神經(jīng)型布魯氏菌病的發(fā)病機制、診斷方法及預防

趙婷婷，趙世剛,2，蘇 霄，劉 丹

布魯氏菌為長0.5～1.5μm，寬0.4～0.8μm，無芽孢、無鞭毛、非運動性、光滑型菌株有微夾膜、兼性寄生的胞內(nèi)革蘭陰性球桿菌。布魯氏菌屬由 Meyer和Shaw于1920年建立，目前由6個物種組成，分別為B.melitensis(主要感染山羊、綿羊及駱駝)，B.abortus(主要感染牛)，B.suis(主要感染豬)，B.canis(主要感染狗)，B.ovis(主要感染綿羊和公羊)，B.neotomae(主要感染沙漠木鼠)，新發(fā)現(xiàn)的物種包括以下6種：B.ceti(主要感染鯨豚類)，B.pinnipedialis(主要感染鰭足類海洋生物)，B.microti(主要感染普通田鼠)，B.papionis(主要感染狒狒)，B.vulpis(主要感染嚙齒類)及Brucellasp(主要感染紅狐)，非典型菌株包括：B.inopinata(BO1分離于乳房傷口中感染的植入物中)，B.inopinata(BO2分離于1名慢性破壞性肺炎的患者身上)及近年來從非洲牛蛙等冷血寄主體內(nèi)分離出的布魯氏菌株[2],前6種也被稱為核心布魯氏菌屬，其中前3種是重要的人獸共患病病原體，感染人類后稱為布魯氏菌病。目前，這些新發(fā)現(xiàn)的物種和非典型菌株對人類的致病性尚不清楚，但不能排除對人的致病性。

1 流行病學

布魯氏菌病為全球性疾病，據(jù)報道，每年有50萬例人布魯氏菌病病例，然而，實際發(fā)病率估計每年為500萬至1 250萬例[1]。它常見于地中海盆地、東歐、南美和中美洲、亞洲、非洲、中東和加勒比地區(qū)。根據(jù)世界動物衛(wèi)生信息數(shù)據(jù)庫，2014年墨西哥報告的疫情數(shù)量最多，為5 514起，緊隨其后的是中國(2 138人)、希臘(1 268人)和巴西(1 142人)。中國疾控中心的數(shù)據(jù)顯示，該病的年發(fā)病率已從2002年的5 000例上升到2015年的6萬多例。在我國，如新疆、內(nèi)蒙古、青海、寧夏、西藏、陜西、吉林等地發(fā)病率較高，其他非牧區(qū)省市也有該病散發(fā)情況[3]。與人類有關的主要傳染源是羊、牛及豬，其次是犬、鹿、馬、駱駝等。傳播途徑包括：經(jīng)皮膚及黏膜接觸，經(jīng)消化道傳播，經(jīng)呼吸道傳播，以及其他經(jīng)蒼蠅攜帶、蜱叮咬傳播[4]。性別、民族、地域分布與布魯氏菌病患者神經(jīng)系統(tǒng)損害無顯著性差異，而年齡的增長以及疾病持續(xù)時間的延長與布魯氏菌病患者神經(jīng)系統(tǒng)損害有統(tǒng)計學差異[5]。Mediha等研究發(fā)現(xiàn)工作人員在處理流產(chǎn)或分娩過程中的雌性反芻動物時可增加布魯氏菌病的發(fā)病率[6]。

2 發(fā)病機制

布魯氏菌病及神經(jīng)型布魯氏菌病的發(fā)病機制較為復雜，細菌、毒素以及變態(tài)反應均有不同程度地參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。了解布魯氏菌病的發(fā)病機制將有助于更好的理解神經(jīng)型布魯氏菌病的發(fā)病機制。最新發(fā)現(xiàn)的可能機制包括以下幾種。

2.1 布魯氏菌病的發(fā)病機制

2.1.1免疫機制 在Rongjiong Z等的meta分析中表明,人類布魯氏菌病患者的CD4+T細胞比例顯著下降，而CD8+T細胞比例增高，CD4+/CD8+比值顯著下降[7]，CD4+T淋巴細胞功能障礙與慢性布魯氏菌病有關，CD8+T在復發(fā)或有癥狀的患者中明顯增多。Rafiei 等發(fā)現(xiàn)，慢性布魯氏菌病患者外周血中分泌干擾素-γ的T淋巴細胞比例明顯低于急性期患者，而產(chǎn)生IL-13的T淋巴細胞比例明顯增加，同時Th1/Th2比例失調，Th2細胞分泌的細胞因子增多。布魯氏菌表達免疫原性OVA(雞卵清白蛋白)，研究表明表達針對OVA peptide SIINFEKL的TCR可變區(qū)域的轉基因小鼠稱為OT-1，OT-1 TCR轉基因T細胞可通過OVA-TCR對感染的布魯氏菌觸發(fā)強烈的細胞因子和CTL反應，CD8+T細胞識別OVA-TCR，但這些OVA-TCR被MHC-II呈現(xiàn)的不連續(xù)五聚體覆蓋，并被CD4+T細胞識別，具有相似程度的潛在交叉反應活性[8]。研究報道，細胞因子具有活化巨噬細胞的功能，布魯氏菌表面蛋白Omp25除了下調TNF-α外，還能抑制LPS-induced白介素PAMs p40和IL-6表達[9]，從而抑制巨噬細胞的活化，也就失去了巨噬細對布魯氏菌的免疫功能，導致感染慢性化。Yuehua等認為BrucellaVirB T4SS是一種重要的毒力因子，能夠調節(jié)細菌細胞內(nèi)存活和控制宿主對感染的免疫反應[10]。

2.1.2其他機制 在Hull等一文中發(fā)現(xiàn)[1]，赤蘚糖醇是由妊娠動物的胎盤組織產(chǎn)生的，可被布魯氏菌用作生長刺激因子和碳源，優(yōu)于葡萄糖。從胎盤釋放的赤蘚糖醇進入循環(huán)系統(tǒng)導致布魯氏菌從淋巴結轉移到生殖組織，重點侵犯絨毛膜絨毛，并且延伸至胎盤胎兒側的子葉，在此細菌大量繁殖(1 013個細菌/克組織)，誘導炎癥細胞浸潤，滋養(yǎng)細胞壞死，導致血管炎，這最終導致胎兒-母體代謝交換受損，導致胎兒流產(chǎn)。流產(chǎn)事件中排出的胎兒和胎盤組織及相關液體是動物種群中的主要傳染源，根據(jù)環(huán)境的適宜性(濕度、土壤組成、溫度、紫外線照射等)，這些布魯氏菌可存活長達一年。Elodie等研究發(fā)現(xiàn)小鼠在感染B.abortus和B.melitensis48 h后可誘導不同類型細胞(包括髓細胞和非髓細胞)的線粒體發(fā)生快速分裂，這種分裂影響布魯氏菌繁殖和TNF-α誘導的細胞凋亡[11]。Elias等建立的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌具有致病性的雙組分系統(tǒng)RegB/A，在控制及適應缺氧環(huán)境和體內(nèi)持久感染方面發(fā)揮著重要作用[12]，這也是慢性感染及臨床耐藥的機制之一。Tayse等研究表明B.canis在胎、新生兒組織巨噬細胞中廣泛分布，但也可侵襲體內(nèi)不同種類細胞，包括腸上皮細胞、腎小管上皮細胞、脂肪細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、脈絡叢細胞、子宮肌層細胞、骨細胞、成骨細胞、滑膜細胞、肝細胞和膠質細胞等。青少年患有布魯氏菌病伴有canis4型動脈瘤的報道提示，可能是由于平滑肌細胞直接感染所致[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，結核桿菌可能導致人體內(nèi)巨噬細胞功能障礙、貧血和低蛋白血癥，這使得結核病患者更容易感染布魯氏菌病[14]。

2.2 NB的發(fā)病機制

2.2.1布魯氏菌直接或間接侵入血腦屏障 Miraglia等發(fā)現(xiàn)，采用體外人血腦屏障即人大腦微血管內(nèi)皮細胞BBB模型研究B.abortus與大腦血管內(nèi)皮細胞的相互作用，發(fā)現(xiàn)盡管B.abortus能夠侵入HBMEC并在HBMEC中復制，但細菌本身不能通過HBMEC，而是通過受感染的單核細胞以極化狀態(tài)穿過HBMEC單層膜，同時布魯氏菌還可以利用屏障細胞間的非細胞遷移穿越HBMEC。重要的是，通過HBMEC單層的受感染單核細胞是膠質細胞感染的細菌來源[15]。B.abortus能夠粘附和侵襲HBMEC，這依賴于真核細胞的微管、微絲、核內(nèi)體酸化和從頭合成蛋白，近年來，肌動蛋白重組被認為是布魯氏菌對胎鼠上皮細胞侵襲、內(nèi)化和細胞內(nèi)轉運的關鍵因素。

2.2.2血腦屏障和激活和/或功能障礙 中樞神經(jīng)型布魯氏菌病的發(fā)病機制多數(shù)與血腦屏障(HBMEC)的激活和/或功能障礙有關，Miraglia等研究發(fā)現(xiàn)感染布魯氏菌的人類神經(jīng)膠質細胞分泌IL-1b和TNF-α，但HBMEC的激活依賴IL-1b免疫介導[16]，最終導致HBMEC內(nèi)皮細胞破壞，血管通透性增加，中性粒細胞及單核細胞遷移，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。

2.2.3蛋白激酶通路的激活 大量研究報道布魯氏菌感染人體后可誘導機體產(chǎn)生炎性細胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)，細胞因子通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，使星形膠質細胞產(chǎn)生基質金屬蛋白酶(MMP)，B.abortus表面蛋白L-Omp19或Pam3Cys也可以激活p38和Erk1/2 MAPK通道誘導星形膠質細胞分泌MMP-9[17]，MMP是一類鈣和鋅依賴的蛋白酶，尤其是MMP-9可以降解血腦屏障和中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的許多結構成分，包括IV型膠原蛋白、椎板蛋白和纖連蛋白。

2.2.4先天免疫細胞受體上調 Kim等研究發(fā)現(xiàn)，感染B.melitensis的獼猴白質星形膠質細胞TLR2表達增加，導致先天免疫激活增加[18]。

2.2.5神經(jīng)細胞脫髓鞘 另外有學者認為慢性神經(jīng)型布魯氏菌病是免疫介導的脫髓鞘病變[19]。

2.2.6神經(jīng)節(jié)苷酯抗體形成 動物實驗模型中發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌表面的神經(jīng)節(jié)苷酯類似物刺激抗神經(jīng)節(jié)苷酯抗體(GM1)形成，最終導致肌無力及共濟失調癥狀[20-21]。

3 臨床表現(xiàn)

3.1 布魯氏菌病的臨床表現(xiàn)

3.1.1全身表現(xiàn) 布魯氏菌病的全身癥狀無特異性，可表現(xiàn)為發(fā)熱、疲乏無力、大汗、關節(jié)疼痛、食欲下降、體重下降、頭痛、肌肉疼痛、抗利尿激素綜合征[22]、腰痛及神經(jīng)系統(tǒng)受損等表現(xiàn)[5,23-24]，其中最常見的癥狀為頭痛及發(fā)熱。

3.1.2局部表現(xiàn) 局部可表現(xiàn)為肝脾腫大、關節(jié)炎、感染性心內(nèi)膜炎及起搏器后心內(nèi)膜炎等。

3.2 NB的臨床表現(xiàn)

3.2.1NB的主要臨床表現(xiàn) NB的臨床表現(xiàn)復雜多樣，主要表現(xiàn)為腦膜炎、腦膜腦炎、腦膿腫、硬膜外膿腫、肉芽腫形成、假性腦瘤形成、脊髓炎、神經(jīng)根神經(jīng)炎、顱神經(jīng)受累、癲癇、精神障礙及血管受累癥狀(靜脈竇血栓、缺血性腦卒中及動脈瘤)等。

3.2.2其他罕見表現(xiàn) NB偶可見孤立性顱內(nèi)壓增高，格林巴利綜合征，顱后窩膿腫、硬膜下出血及彌漫性脊髓蛛網(wǎng)膜炎等。在趙世剛等的臨床研究提示周圍神經(jīng)型布魯氏菌病較中樞神經(jīng)型布魯氏菌病常見，且感覺神經(jīng)較運動神經(jīng)易受累，同時總結出周圍神經(jīng)型布魯氏菌病臨床表現(xiàn)主要包括四肢末端對稱或不對稱性麻木、痛覺過敏及發(fā)涼、燒灼感等，肢體腱反射減退或消失，肢體無力、癱瘓及肌肉萎縮等，其次為聽神經(jīng)、面神經(jīng)及動眼神經(jīng)損害，并得出周圍神經(jīng)型布魯氏菌病電生理改變既有脫髓鞘損害又有軸索損害[5,23]。

4 診斷方法及進展

結合流行病學接觸史、癥狀、體征及輔助檢查可確診。目前大多數(shù)國家使用的輔助檢查仍然為標準試管凝集試驗、抗人球蛋白試驗、虎紅平板凝集試驗、硫醇基試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和布魯氏菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法，但鑒于傳統(tǒng)方法的特異度、靈敏度及實驗室污染等問題，目前聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術為檢測布魯氏菌提供了一種靈敏、特異的方法[25-26]。1990年，F(xiàn)ekete等首次提出了基于PCR的布魯氏菌病檢測方法。Baddour等比較了布魯氏菌的3對引物擴增3個不同片段的敏感性，其中包括編碼BCSP31(b4/b5)的基因、16SrRNA序列(f4/f2)和OMP2的基因(jpf/jpr),結果表明，B4/B5引物對、JPF/JPR引物對和F4/R2引物對的敏感性分別為98%、88.4%和53.1%。Kattar等利用16-23S ITS、OMP25和OMP31的雜交探針和引物，開發(fā)了3種實時PCR(real-time PCR)技術，用于在屬水平上診斷人類布魯氏菌病,結果表明，以16S-23S為引物和探針的實時PCR反應靈敏度最高[27]。此外，一項研究分析了利用引物和針對IS711、BCSP31和PER基因的TaqMan探針建立的3種實時PCR方法的敏感性和特異性，結果表明，基于IS711的實時PCR檢測布魯氏菌最靈敏、特異及高效[28]。Rabehi等研究表明，乳汁中的布魯氏菌排泄量較低，但足以引起感染，以布魯氏菌IS711插入序列為引物，使用real-time PCR檢測牛奶樣本中的此序列，似乎比血清學檢測有優(yōu)勢，使用這一程序可以作為農(nóng)場動物的常規(guī)篩選試驗[29]。眾所周知，布魯氏菌病和肺外結核的某些局灶性并發(fā)癥很難在臨床、生物學和放射學上加以鑒別，多重實時PCR(multiplex real-time PCR, MRT-PCR)是PCR的一種變體，比實時PCR診斷更加準確，能夠同時測序2個或多個目標序列，加快了以上兩種疾病的鑒別診斷[30]。比實時PCR及多重實時PCR更精確的檢查方法目前為基質輔助激光脫附/電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析技術，即一種新的蛋白質提取方案，該方法建立在蛋白質譜特征的基礎上，是一種快速、經(jīng)濟、準確的分析生物樣品的方法[31]，為實驗室安全和公共衛(wèi)生提供了保障，即使布魯氏菌之間最小的基因組差異，MALDI-TOF-MS分析也可以識別，這使屬、種和生物變異鑒定成為可能。Johansen等使用全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)對布魯氏菌進行準確分型[32]，因為WGS可以對該細菌的整個基因組進行研究，從而提高區(qū)分能力,同時可以進行耐藥性測試，耐藥性的檢測能夠為更多的抗生素建立斷點及制定據(jù)藥敏選藥的指南提供理論依據(jù)。結合病史以及在腦脊液中使用以上檢測方法有助于對中樞神經(jīng)型布魯氏菌病的確診，但目前國內(nèi)研究較少。通過病史及以上檢測方法再聯(lián)合肌電圖、神經(jīng)彩超將有助于周圍神經(jīng)型布魯氏菌病的診斷。

5 治療

世界衛(wèi)生組織建議急性布氏菌病患者應選擇多西環(huán)素(每次100 mg，每d 2次)聯(lián)合利福平(每次600～900 mg，每d 1次)持續(xù)6周口服治療。由于頭孢曲松可自由擴散到體液中[33]，在我國，主要以多西環(huán)素和利福平聯(lián)用為基礎，再加用頭孢曲松、氨基糖甙類或喹諾酮類其中的一種進行聯(lián)合治療，療程根據(jù)病情而定，從6周至4～6個月不等[34]，合并神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的患者應加用改善循環(huán)及營養(yǎng)神經(jīng)等藥物對癥治療。趙世剛等的研究中得出布魯氏菌病患者合并復雜顱內(nèi)感染應給予三聯(lián)抗生素治療，并且該治療應持續(xù)到臨床表現(xiàn)與腦脊液指標恢復正常，這個過程一般至少6周[5]。Tsevelmaa等研究表明，蒙藥即蒙兜鈴根提取物聯(lián)合多西環(huán)素等抗生素治療布魯氏菌病，可降低高劑量抗生素的毒性，防止抗生素耐藥性的發(fā)生，預防布魯氏菌感染[35]。

6 疫苗研究進展及預防

6.1布魯氏菌病不僅對家畜構成威脅，而且是全球性的公共衛(wèi)生問題。鑒于布魯氏菌病及神經(jīng)型布魯氏菌病嚴重的致殘性，疫苗的研制迫在眉睫，這降大幅度降低神經(jīng)型布魯氏菌病的發(fā)生，最新研發(fā)的疫苗如下。

沙門氏菌是一種胞內(nèi)病原菌，其細胞感染機制與布魯氏菌相似，Mwense等研究發(fā)現(xiàn)以傷寒沙門氏菌為基礎的聯(lián)合疫苗對羊布魯氏菌4種外源抗原(超氧化物歧化酶(SOD)、外膜蛋白19(Omp19)、布魯氏菌聯(lián)氨合成酶(BLS)、脯氨酸外消旋酶亞基A(PrpA))在傳遞免疫原性方面是有效的，接種高劑量疫苗能夠有效地控制山羊布魯氏菌病[36]。另有研究構建了表達流產(chǎn)布魯氏菌BCSP31、Omp3b和SOD蛋白的活減毒傷寒沙門氏菌株，在小鼠模型中的免疫途徑比較發(fā)現(xiàn)，SOD蛋白的減毒活疫苗對毒性B.abortus感染表現(xiàn)出最佳的保護作用，并顯示此減毒活疫苗可誘導小鼠產(chǎn)生穩(wěn)定的黏膜和細胞介導的免疫反應。此外，這些結果表明，如果減毒株在人類中被證明是安全的，那么聯(lián)合表達各種抗原的活減毒傷寒沙門氏菌株，如BCSP31、Omp3b和SOD，可以作為對抗布魯氏菌病的候選疫苗進行研究[37-38]，從而減少布魯氏菌對神經(jīng)系統(tǒng)的損害。

值得注意的是，布魯氏菌有兩種菌落形態(tài)，一種形式是光滑的物種，它包含光滑的O-側鏈脂多糖(sLPS)。光滑布魯氏菌包括B.melitensis，B.abortus和B.suis。另一種形態(tài)是缺乏O-側鏈脂多糖(rLPS)的粗糙種。粗布魯氏菌包括B.canis和B.ovis。目前，有兩種疫苗被批準用于流產(chǎn)B.bovids的動物種群，即sLPS(S19)和rLPS(RB51)。第3種疫苗是rLPS (S45/20)，目前尚未在美國獲得許可。然而有一種疫苗sLPS(Rev1)是允許使用的，主要用于小反芻動物中B.melitensis的感染[39]。雖然這些疫苗不能防止布魯氏菌在動物體內(nèi)的定植和感染，但它降低了流產(chǎn)事件發(fā)生的可能性，打破了傳播的循環(huán)，保護了獸群中剩余的動物[40]，從而降低人類布魯氏菌病及神經(jīng)型布魯氏菌病的發(fā)生。

6.2預防 診斷、治療/根除和預防是專家經(jīng)常推薦的黃金法則，為預防神經(jīng)型布魯氏菌病，除了疫苗接種以外，首先需要對流行地區(qū)的田間農(nóng)民、田間工作者和當?shù)厣鐓^(qū)進行適當?shù)慕】敌獭Ｈ绻芨腥镜膭游锾幱诼愿腥緺顟B(tài)，應將其宰殺，以防止疾病傳播。對實驗室用具和實驗室工具的定期消毒也會減少臨床實驗室人員的感染。此外，還需要一項有效的全球政策來徹底根除布魯氏菌病，須執(zhí)行適當?shù)墨F醫(yī)立法，并鼓勵施行有關動物健康的政策。當患者出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、關節(jié)疼痛、肢體麻木癱瘓等癥狀時應高度考慮神經(jīng)型布魯氏菌病的發(fā)生。

7 總結與展望

雖然近年來有關神經(jīng)型布魯氏菌病的研究報道有所增加，但與其他常見病、多發(fā)病的研究相比，其文獻量仍存在很大的差距，而神經(jīng)型布魯氏菌病危害性大，臨床特點復雜多變，慢性布魯氏菌病臨床癥狀更不明顯，隨著科學界對布魯氏菌病越來越感興趣，我們還需要一種針對布魯氏菌的廣譜疫苗，以便在全世界徹底根除這種疾病[25]。

利益沖突：無