冬凌草甲素/殼聚糖復(fù)合膜的性能和結(jié)構(gòu)表征

糾敏，孟媛媛，王倩，汪倫記, 2*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)2(河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽，471023)

食品包裝能夠通過保護(hù)食品免受外來物理、化學(xué)及生物因素的破壞而較長時(shí)間維持食品質(zhì)量和營養(yǎng)價(jià)值[1]。隨著人們對(duì)食品品質(zhì)和安全的認(rèn)識(shí)和要求日益提高，開發(fā)高效綠色、抗菌性強(qiáng)，安全無毒的食品包裝已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。綠色涂膜基材有多糖和蛋白質(zhì)類等可食性與聚乙烯醇等非可食性的兩大類[2-3]。殼聚糖為甲殼質(zhì)脫乙酰的產(chǎn)物，由2-乙酰胺基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖通過β-D-(1-4)糖苷鍵連接而成的線型聚合物，具有良好的生物相容性、可降解性、再生性、抗菌防腐性及成膜性等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的多糖類涂膜材料[4]。目前，殼聚糖已廣泛應(yīng)用于食品和果蔬包裝。但單一殼聚糖膜具有耐水性較差和抑菌譜較窄的缺點(diǎn)[5]，因此，向其中添加天然抑菌劑，如牛至精油、百里香精油和肉桂醛等[6-9]，以改善膜的抗菌性和耐水性滿足不同食品的包裝需要。冬凌草甲素(Oridonin)是一種從唇形科香茶菜屬植物中提取出的貝殼杉烯二萜類天然有機(jī)化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性[10,11]，對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、肺炎雙球菌等都有一定的抑制作用[12-14]。作者前期研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素對(duì)志賀氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌也具有抑菌活性。冬凌草的應(yīng)用已開發(fā)有冬凌草茶和保健牙膏等產(chǎn)品，但目前對(duì)其用于食品防腐保鮮的研究鮮有報(bào)道。本文對(duì)冬凌草甲素/殼聚糖復(fù)合膜的物理特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并考察了其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果，以期為冬凌草應(yīng)用于食品的防腐保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冬凌草甲素(純度98%)，上海源葉生物科技有限公司；殼聚糖(脫乙酰度≥90%)、酵母膏、蛋白胨、瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸、甘油、NaCl(分析純)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；Staphylococcusaureus和Escherichiacoli，中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母膏5 g，蒸餾水1 000 mL，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4。121 ℃滅菌20 min備用。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min備用。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)(UV2600)，日本SHIMADZU公司；傅里葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀(VERTEX 70)，德國BRUCHER儀器公司；波通物性分析儀(TVT-6700)，瑞典PERTEN公司；掃描電鏡(TM3030 PLUS)，日本日立高新技術(shù)公司；差示掃描量熱儀(DSC1)，瑞士METTLER TOLEDO公司；單尖頭數(shù)顯千分尺，東莞市景有模具五金有限公司。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合膜液和復(fù)合膜的制備

準(zhǔn)確稱取2 g殼聚糖，溶于100 mL質(zhì)量濃度為10 g/L乙酸溶液中，在常溫下攪拌4～5 h，加入1 mL質(zhì)量濃度為60 g/L的甘油作為增塑劑，攪拌混合1 h后，加入冬凌草甲素使其終濃度分別為100、75、50、25 μg/mL，攪拌混合30 min，靜置過夜超聲脫氣。取上述制備好的復(fù)合膜液10 mL加入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中流延成膜后，于鼓風(fēng)干燥箱中，35 ℃干燥24 h成膜，按照相同方法制備殼聚糖膜液和殼聚糖膜為對(duì)照。

1.2.2 復(fù)合膜物理性能的測(cè)定

(1)厚度：使用數(shù)顯千分尺(精度為0.001 mm)測(cè)量復(fù)合膜厚度，在膜的中心及四角周邊隨機(jī)選擇8個(gè)點(diǎn)，測(cè)厚度后取平均值，單位為mm。

(2)透光率：將復(fù)合膜裁剪成4 cm×1 cm的長方形，與比色皿的一側(cè)緊貼，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量膜在600 nm波長處的吸光度[15-16]，每個(gè)樣品3次平行實(shí)驗(yàn)。按公式(1)計(jì)算：

透光率/% =10-A600 nm×100

(1)

式中：A600 nm，600 nm波長處的吸光度。

(3)水蒸氣透過系數(shù)(water vapour permeability，WVP)：在稱量杯中加3 g經(jīng)干燥過的CaCl2，用密封蠟將復(fù)合膜覆蓋密封稱量杯。稱量杯在相對(duì)濕度為100%的恒濕箱內(nèi)存放，每隔24 h稱取透濕杯的質(zhì)量，連續(xù)3次，每個(gè)樣重復(fù)3次，單位時(shí)間稱量杯質(zhì)量的變化為復(fù)合膜的水蒸氣透過率(WVP)[17]；按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：W為透濕杯的增重，g；x為復(fù)合膜的厚度，mm；A為膜透水蒸氣的面積，/m2；T為2次稱量間隔時(shí)間，h；Δp為復(fù)合膜內(nèi)外兩側(cè)的氣壓差，取3.168 kPa。

(4)拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率：將膜樣品裁剪成長150 mm，寬20 mm，使用物性分析儀測(cè)定其拉伸強(qiáng)度(tensile strength，TS)和斷裂伸長率(elongation at break，EAB)[18]。2個(gè)探頭的初始夾距80 mm，拉伸速度0.6 mm/s每個(gè)樣5次平行實(shí)驗(yàn)，按公式(3)和(4)計(jì)算：

(3)

(4)

式中：F為試樣斷裂時(shí)承受的最大張力，N；L為膜樣品的寬度，mm；W為膜樣品的厚度，mm；L1為膜拉伸后斷裂時(shí)的長度，mm；L0為膜樣品的長度，mm。

1.2.3 復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)表征

(1)傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR)分析[19]：將制備的復(fù)合膜真空冷凍干燥后，取少量樣品與KBr研磨后壓片，對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，掃描范圍為500～4 000 cm-1。

(2)掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分析：將制備的復(fù)合膜剪成直徑為6 mm的圓片，用掃描電鏡觀察膜的表面。

(3)熱穩(wěn)定性分析[15]：將制備的膜樣品放入35 ℃干燥箱，平衡2 d，稱取10 mg左右的膜樣品置于坩堝中，從0 ℃加熱至150 ℃。升溫速率為10 ℃/min，樣品室氮?dú)饬髁繛?00 mL/min。用差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry，DSC)對(duì)膜的熱穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試。

1.2.4 復(fù)合膜液抗菌性能的測(cè)定

(1)菌種活化和菌懸液制備：挑取1～2環(huán)供試菌，接入試管斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液。采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ脽o菌生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)菌含量為1×108CFU/mL。

(2)抗菌性能[20]：在滅菌培養(yǎng)皿中加入10 mL固體培養(yǎng)基，冷卻凝固后按一定次序放入數(shù)個(gè)滅菌的牛津杯。將0.1 mL菌懸液加入到冷卻至46 ℃左右的10 mL固體培養(yǎng)基中，混勻后倒入滅菌平板，冷卻后用無菌鑷子取出牛津杯。分別加入100 μL冬凌草甲素質(zhì)量濃度分別為100、75、50、25 μg/mL的復(fù)合膜液和殼聚糖膜液，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑。每個(gè)樣3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD的形式表示。組間分析采用One-Way ANOVA兩兩比較得到相應(yīng)的P值，P<0.05和P<0.01為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬凌草甲素對(duì)復(fù)合膜厚度、透光率和水蒸氣透過系數(shù)的影響

冬凌草甲素對(duì)復(fù)合膜的厚度、透光率和水蒸氣透過系數(shù)的影響見表1。由表1可知，殼聚糖中加入冬凌草甲素，復(fù)合膜的厚度基本沒有變化；透光率則隨著冬凌草甲素含量的增加而下降，但差異不顯著。

水蒸氣透過系數(shù)是膜的重要指標(biāo)之一，是影響食品損失率和水分遷移的重要因素。對(duì)復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，冬凌草甲素能改善復(fù)合膜的阻濕性，顯著降低復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)(P<0.05)。這是由于冬凌草甲素是疏水性的物質(zhì)，其親水性能較弱，當(dāng)加入殼聚糖中時(shí)，可降低水分子通過復(fù)合膜的吸附和擴(kuò)散速率。但復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)隨著冬凌草甲素的濃度增加，其下降的趨勢(shì)不顯著。這與SNCHEZ-GONZLEZ等[21]報(bào)道的疏水性化合物由于其疏水性而增強(qiáng)了聚合物基膜的水阻隔性能，降低了膜的水蒸氣透過能力的結(jié)果一致。

表1 冬凌草甲素對(duì)復(fù)合膜厚度、透光率與水蒸氣透過系數(shù)的影響Table 1 Effect of Oridonin on thickness, light transmittance and water vapor permeability of the composite films

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 冬凌草甲素對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響

冬凌草甲素對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響見表2。由表2可知，隨著冬凌草甲素添加量的增加，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度與斷裂伸長率逐漸下降。與殼聚糖膜相比，冬凌草甲素質(zhì)量濃度為50、75和100 μg/mL時(shí)，復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度分別降低了6.91%、10.80%和16.00%，斷裂伸長率分別降低了10.50%、12.98%和20.95%，差異顯著(P<0.05)。復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率的降低可能是由于冬凌草甲素與殼聚糖分子間的相互作用影響了殼聚糖分子骨架間的內(nèi)聚力，改變了復(fù)合膜中殼聚糖分子的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；同時(shí)由于添加冬凌草甲素使膜的疏水基增加，導(dǎo)致應(yīng)力減少，使得復(fù)合膜的機(jī)械性能降低[22]。

表2 冬凌草甲素對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響Table 2 Effect of Oridonin on the mechanical properties of the composite films

2.3 復(fù)合膜的傅里葉變換紅外光譜分析

a為殼聚糖膜；b～e分別為含冬凌草甲素質(zhì)量濃度為25、50、75和100 μg/mL的復(fù)合膜圖1 復(fù)合膜的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of the composite films

2.4 復(fù)合膜的掃描電鏡圖

復(fù)合膜的掃描電鏡圖見圖2。由圖2-a可知，殼聚糖膜的表面光滑，平整。當(dāng)冬凌草甲素添加量為25 μg/mL時(shí)，其能較均勻地分散于殼聚糖膜中，復(fù)合膜表面比較光滑平整，沒有出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，不存在裂縫和小孔。隨著冬凌草甲素添加量的繼續(xù)增加，復(fù)合膜表面變得越來越粗糙(圖2-b～圖2-e)，說明冬凌草甲素與殼聚糖的相容性隨著其含量的增加而降低，導(dǎo)致其在膜中分布不均勻，出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，致使界面受力不均勻，降低復(fù)合膜的機(jī)械性能。

a為殼聚糖膜；b～e分別為含冬凌草甲素質(zhì)量濃度為25、50、75和100 μg/mL的復(fù)合膜圖2 復(fù)合膜的掃描電鏡圖(1 000×)Fig.2 The SEM photographs of the composite films

2.5 復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性分析

冬凌草甲素對(duì)復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性的影響見圖3。由圖3可知，冬凌草甲素能提高復(fù)合膜的熱變性溫度。殼聚糖膜的熱變性溫度為95.14 ℃，冬凌草甲素與殼聚糖共混后制備的復(fù)合膜熱變性溫度均高于單一殼聚糖膜，當(dāng)冬凌草甲素質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，復(fù)合膜的熱變性溫度最高達(dá)到118.43 ℃，說明冬凌草甲素和殼聚糖具有較好的相容性，兩者共混后形成了較為牢固的結(jié)構(gòu)，提高了復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性。

a為殼聚糖膜；b～e分別為含冬凌草甲素質(zhì)量濃度為25、50、75和100 μg/mL的復(fù)合膜圖3 復(fù)合膜熱穩(wěn)定性曲線圖Fig.3 DSC curves of the composite films

2.6 復(fù)合膜液的抑菌性能

復(fù)合膜液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用見圖4。由圖4可知，冬凌草甲素能提高復(fù)合膜液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，并隨著冬凌草甲素質(zhì)量濃度的增加而增加。殼聚糖膜液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為(11.02±0.020)mm和(13.04±0.010)mm，而冬凌草甲素質(zhì)量濃度為50 μg/mL的復(fù)合膜液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為(14.12±0.012)mm和(14.86±0.012)mm，抑菌活性分別提高了28.13%和12.57%，差異顯著(P<0.05)。研究表明，殼聚糖的正電荷能與微生物細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互作用，通過改變細(xì)胞膜的通透性而起到殺菌作用[24]。冬凌草甲素可通過破壞細(xì)胞膜的通透性,抑制菌體的呼吸代謝和蛋白質(zhì)的合成等途徑殺菌[25]。這可能由于冬凌草甲素和殼聚糖不同的殺菌機(jī)制，當(dāng)兩者共混成膜后，復(fù)合膜的抑菌活性得到增強(qiáng)。

a為殼聚糖膜；b～e分別為含冬凌草甲素質(zhì)量濃度為25、50、75和100 μg/mL的復(fù)合膜圖4 復(fù)合膜液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of the complex film liquids on E.coli and S. aureus

3 結(jié)論

隨著冬凌草甲素含量的增加，復(fù)合膜的厚度基本沒有變化，透光率、拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率逐漸下降，水蒸氣透過系數(shù)顯著降低(P<0.05)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯增強(qiáng)。對(duì)復(fù)合膜微觀結(jié)構(gòu)的研究顯示,冬凌草甲素與殼聚糖的功能基團(tuán)形成了氫鍵，有較好的相容性，有利于冬凌草甲素在殼聚糖膜中分散均勻，形成表面較光滑的復(fù)合膜表面。冬凌草甲素質(zhì)量濃度為50 μg/mL的復(fù)合膜的各項(xiàng)性能指標(biāo)良好，熱穩(wěn)定性最好，其復(fù)合膜液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性分別提高了28.13%和12.57%，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。