水解制備細菌纖維素納米纖維及納米纖維穩定的Pickering乳液特性

劉子菲，路蘋，高子喬，賈梅杰，翟希川，林德慧，楊興斌

(陜西師范大學，陜西省食品綠色加工與安全控制工程實驗室，陜西 西安，710119)

細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是一類由微生物發酵產生的胞外多糖，屬納米級纖維，已被世界公認為性能最好、實用價值較好的纖維素。細菌纖維素具有許多優良的特性：超細超純；高持水和保水性，具有極強的水結合性；高抗張強度和彈性模量；比表面積大；生物適應性和生物可降解性等[1-3]。加之其安全性在1992年已被美國食品與藥品管理局接受和認可，因而被廣泛應用于醫學、造紙、納米材料等領域[4-9]。近年來，細菌纖維素在食品領域作為增稠劑、填充劑、脂肪替代品等也備受關注，但細菌纖維素在食品乳化劑方面的應用研究鮮有報道。

乳液是由兩種不相溶的液體通過添加乳化劑或穩定劑所形成的，廣泛應用于制藥、化妝品和食品等行業中。20世紀初，皮克林(Pickering)對由固體顆粒穩定的乳液進行了系統研究。因此，在溶液中以固體膠粒或納米顆粒作為乳化劑形成的乳液稱作Pickering乳液[10-12]。固體顆粒與表面活性劑均具有乳化作用，但其作用機理及乳化方式卻不相同，表面活性劑乳化體系是亞穩定體系，屬于熱力學不穩定體系，表面活性劑在油/水界面上的吸附是一種動態平衡，在一定的條件下可以快速吸附與脫附[13-14]。以表面活性劑為乳化劑時，油相的不同會影響形成乳液的類型，在某些條件下，表面活性劑乳化體系還容易發生轉相，而運用固體顆粒乳化可以制得動力學、熱力學均非常穩定的油/水分散體系[15]。因此，Pickering乳液成為當前食品行業的研究熱點[16-18]。目前，多糖是乳化劑的研究熱點，動植物多糖因生產周期較長和提取純化過程復雜而受到限制，因此，來源廣泛、易于提取純化的微生物多糖成為乳化劑的研發熱點[19-21]。基于此，本實驗在單因素的基礎上，采用響應面分析法，對影響納米纖維粒徑的4個主要影響因素(鹽酸濃度、水解溫度、水解時間、料液比)進行優化。利用Design-Expert軟件的Box-Benhnken design(BBD)模式建立試驗數學模型[22-24]，確定最佳水解條件。同時，本實驗利用水解所得的納米纖維制備Pickering乳液，并對Pickering乳液的特性進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；菌株KomagataeibacterxylinusCGMCC 3917：中國菌種保藏中心，純水：實驗室制備。

1.2 儀器與設備

AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器公司；101-2AB電熱鼓風干燥機，北京中興偉業儀器公司；SHA-C/SHA-B/THZ-82水浴恒溫振蕩器，華普達儀器公司；PHSJ-3F pH計，雷磁儀器廠；99-1磁力攪拌器，常州國華電器公司；TD5A-WS離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；PA-200X馬爾文激光粒度分析儀，孚光精儀公司；LVEM5透射電子顯微鏡，北京昊諾斯科技有限公司；Milli-Q Integral 15 型純水/超純水一體機，上海金甚生物科技有限公司；F6/10-10G高速剪切攪拌機，德國IKA公司；Panda Plus高壓均質機，意大利帕爾瑪公司；milli-Q Integral 15型純水-超純水-體機，德國密理博；F6/10-10G高速剪切攪拌機，德國Fluco；Panda Plus高壓均質機，意大利Parna。

1.3 方法

1.3.1 細菌纖維素的制備

菌株KomagataeibacterxylinusCGMCC3917接種在發酵培養基中(pH 5.0)(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物5，K2HPO410，MgSO415，乙醇20[25]，30 ℃靜態培養14 d。將收獲的纖維素膜用自來水過夜沖洗后，浸泡于0.1 mol/L NaOH溶液(80℃)，30 min后用去離子水沖洗纖維素膜至中性。把純化后的纖維素膜放入無菌水中，并儲存于4℃的冰箱[26]。

1.3.2 納米纖維素的制備

根據文獻[27]的方法制備納米纖維素。將純化后的細菌纖維素濕膜在粉碎機中粉碎5 min(15 000 r/min)，得到纖維素懸浮液。然后將纖維素懸浮液離心(3 040 ×g) 10 min去除游離水，將所得的纖維用鹽酸進行水解。水解后，懸浮液用去離子水洗滌并離心(10 000 ×g)至pH為中性并儲存在4℃冰箱里[28]。

(1)細菌纖維素水解單因素實驗

將5 g細菌纖維素用不同梯度濃度鹽酸配置成不同梯度的料液比，于沸水浴處理一定時間后終止反應，加超純水洗滌并離心至中性，得到細菌纖維素樣品，測定該樣品粒徑，選取最接近的水平作為最優水平。每個處理進行3次重復。

選取水解時間(1、2、3、4、5、6 h)，料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)(g∶mL)，水解溫度(60、70、80、90、100℃)，鹽酸濃度(2、3、4、5、6 mol/L)

(2)細菌纖維素水解條件優化實驗設計

采用Design-Expert 7.0.0 Trial中Box-behnken設計模式來進行試驗設計與數據分析。以鹽酸濃度、溫度、時間、料液比4個因素為自變量，分別以X1、X2、X3、X4表示，并根據現有試驗條件，在單因素試驗的基礎上，確定了各影響因素合適的條件范圍，分別為2～4 mol/L、60～80 ℃、3～5 h、1∶5～1∶15，以納米纖維素的得率作為響應值Y，試驗自變量因素編碼及水平見表1。

1.3.3 納米細菌纖維素粒徑的測量

將水解后的細菌纖維素納米纖維的粒徑大小按照參考文獻YAN等的方法[29]，做了一定修改，將水解后的納米纖維分散在PBS溶液中，利用馬爾文激光粒度儀對其粒徑大小進行測量分析。馬爾文激光粒度儀測定的粒徑是粒子的等效體積直徑，其粒徑大小根據公式(1)計算:

(1)

式中：ni表示相似粒徑大小的粒子數量，di表示粒子大小。

表1 實驗自變量水平及編碼水平Table 1 Experimental variable level and encoding level

1.3.4 制備Pickering乳液

用上述所制備的細菌纖維素納米纖維作為Pickering乳液穩定的固體顆粒，添加0.03%(質量分數)的納米纖維在20/80的油/水體系中，該研究中的油相是花生油，水相是10 mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH=7)。將上述制備好的樣品在高速剪切攪拌機中攪拌1 min(15 000 r/min)，然后進行高壓均質。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1-A可知，在鹽酸濃度為1～3 mol/L時，細菌纖維素納米纖維的粒徑顯著減小，且鹽酸濃度為3 mol/L時，細菌纖維素納米纖維的粒徑最小。由圖1-B可知，溫度在60～70℃，納米纖維的粒徑顯著減小，在70℃時，納米纖維的粒徑達到最小；溫度在70～100℃，納米纖維的粒徑隨著溫度升高變化不明顯。由此可知，細菌纖維素最適水解溫度為70℃。由圖1-C可知，水解時間在1～3 h，納米纖維的粒徑顯著減小，水解3 h粒徑達到最小，之后粒徑變化不明顯。可見，細菌纖維素的最適水解時間為3 h。由圖1-D可知，隨著料液比的減小，納米纖維的粒徑顯著減小，在料液比達到1∶10時，納米纖維的粒徑最小，之后變化不明顯。因此，本實驗選取液料比為1∶10。

A-鹽酸濃度;B-水解溫度;C-水解時間;D-料液比圖1 單因素條件對納米纖維粒徑的影響Fig.1 Effects of single factor condition on the particle size of nanofibers

2.2 響應面試驗結果

由表4可知，鹽酸水解細菌纖維素的工藝參數中，影響細菌纖維素粒徑的主要因素按照主次順序排列為鹽酸濃度(X1)=水解溫度(X2)>料液比(X4)>水解時間(X3)，在所選各因素水平范圍X1、X2、X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X12、X22、X32、X42對Y的影響顯著。由此可見，實驗因素對響應值的影響不呈簡單的線性關系，交互項和二次項對響應值有較大的影響作用。

表2 試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results

表3 納米纖維粒徑的多元二次方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model of the particle sizes of the nano fibers

表4 回歸模型方差結果Table 4 Variance result of regression model

2.3 響應面交互作用分析與優化

利用Design-Expert軟件可以做出兩兩自變量為坐標的三維解析表面和二維等高線圖，這些圖不僅可以直觀地反映每個變量對響應量的影響程度，還能很好地揭示因素之間的交互作用。從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，橢圓形反映了兩因素的交互作用較強，而圓形則相反[30]。

圖2顯示了料液比和溫度處于中心水平時，水解時間和鹽酸濃度的交互作用對納米纖維粒徑的影響。從其等高線可直觀地看出，水解時間和鹽酸濃度的交互作用顯著。由圖可知，隨著水解時間的增加，納米纖維的粒徑減小。隨著鹽酸濃度的增加，納米纖維的粒徑迅速減小后呈緩慢減小，因此，在鹽酸濃度為3 mol/L，水解時間為4 h時，納米纖維的粒徑達到最小值。

A-響應曲面圖；B-等高線圖圖2 時間和鹽酸濃度交互作用納米纖維粒徑的影響Fig.2 Interaction effects of hydrochloric acid concentraonand hydrolysis time on the paticle sizes of nano-fibers

圖3顯示了水解時間和溫度處于中心水平時，鹽酸濃度和料液比的交互作用對納米纖維粒徑的影響。由圖可知，此兩因素的交互作用顯著。隨著料液比的增加，納米纖維的粒徑先減小后升高，隨著鹽酸濃度的增加，納米纖維粒徑緩慢減小。

A-響應曲面圖；B-等高線圖圖3 料液比和鹽酸濃度交互作用對納米纖維粒徑Fig.3 Interaction effects of hydrochloric acid concentraon and material ratio on the paticle sizes of nano-fibers

圖4顯示了料液比和鹽酸濃度處于中心水平時，時間和溫度的交互作用對納米纖維粒徑的影響。由圖4可知，水解時間和溫度的交互作用顯著。隨著水解時間的增加，細菌纖維素納米纖維的粒徑減小，隨著水解溫度的增加，納米纖維的粒徑減小，當水解時間為4 h，水解溫度為70℃時，納米纖維的粒徑達到最小值。

A-響應曲面圖；B-等高線圖圖4 時間和溫度的交互作用對納米纖維粒徑的影響Fig.4 Interaction effects of hydrochloric acid concentraon and material ratio on the paticle sizes of nano-fibers

2.4 細菌纖維素納米纖維的Pickering乳液制備及特性

圖5是細菌纖維素水解前和水解后的透射電鏡圖，由圖5-A可知，水解前細菌纖維素由納米纖維絲聚合在一起形成較粗的纖維絲帶，纖維絲帶通過氫鍵相互的交織纏繞在一起形成多孔的網狀結構。由圖5-B可知，水解后纖維絲帶被水解成納米纖維絲，破壞了微纖維絲之間的氫鍵作用力。水解后的納米纖維絲的直徑為30～80 nm,纖維絲的長度為0.5～2 μm。

A-水解前；B-水解后；C-Pickering乳液圖5 細菌纖維素纖維水解前后及Pickering乳液的透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopy (TEM) images of bacterial cellulose fibers before hydrolysis and after hydrolysis, and TEM image of Pickering emulsions stabilized by nano-fibers

已有研究報道，納米纖維具有一定親水及親油特性，從而能夠降低油/水界面的張力起到乳化作用[31]。本課題組在前面研究中也已經證明細菌纖維素納米纖維具有一定的親水和親油特性[32]，因此，利用上述制備的納米纖維來制備Pickering乳液，添加0.03%(質量分數)細菌纖維素納米纖維的油/水體系呈現出均勻的乳狀液。用透射電鏡觀察到乳液液滴呈均勻的球形，大小約為10～30 nm(圖5-C)。

乳液的穩定性是評價乳液的重要指標，本試驗考察了在常溫下，儲藏時間對乳液穩定性的影響。如圖6所示，在常溫下放置4周的Pickering乳液的粒徑沒有顯著的變化，表明所制備的乳液穩定性較好。同時，又考察了溫度對乳液穩定性的影響。由圖7-A可知，在溫度30～90℃乳液的粒徑分布均在100 nm以內，在100℃，乳液的粒徑大于100 nm。根據計算得到乳液的平均粒徑(圖7-B)，30～80℃，隨著溫度的升高，乳液的平均粒徑沒有顯著增大，在80～100℃時乳液的粒徑顯著增大，但也均小于100 nm。乳液的電位也受溫度的影響較小(圖7-C)，沒有顯著變化。綜上所述，表明該乳液的熱穩定性較好，在30～100℃都呈現均勻的乳液(圖7-D)。

3 結論

利用Design-Expert軟件對影響納米纖維素粒徑的4個關鍵參數作了考察，研究表明鹽酸濃度、溫度與時間之間的關系更接近于二次多項式模型。模型的預測值與試驗真實值之間的相關性達93.53%，模型能夠解釋83.75%響應值的變化，說明該模型擬合程度良好。通過響應面等高線圖，直觀地反映了各影響因素之間交互作用的顯著程度。響應面分析表明，

A-乳液粒徑分布；B-乳液平均粒徑圖6 儲存時間對Pickering乳液粒徑的影響Fig.6 Effect of storage time on the particle sizes of Pickering emulsion

各因素間均具有較強的交互作用。通過工藝條件的優化得出的最佳工藝條件為:鹽酸濃度為2.87 mol/L、料液比為1∶7.51 (g∶mL)、水解時間3.50 h、溫度61.72℃。在優化條件下得到納米纖維素的粒徑為520 nm，與理論預測值508 nm較好吻合，表明模型合理有效。

利用水解所得的納米纖維制備Pickering乳液，研究發現，0.03%(質量分數)的納米纖維可穩定20/80的油/水體系，乳液的平均粒徑為30 nm。且在常溫下放置4周后，乳液的粒徑無顯著變化。另外，隨著溫度的升高(30～80℃)，乳液的粒徑也無顯著變化。以上結果表明細菌纖維素納米纖維穩定的Pickering乳液顯示出良好的熱穩定性。

A-乳液的粒徑分布；B-乳液的平均粒徑；C-乳液的電位；D-乳液的外觀圖7 溫度對Pickering乳液的特性影響Fig.7 Influence of temperature on properties of Pickering emulsion