嚴格厭氧嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌產纖維素酶條件的優化

章亭洲,朱廷恒，王騰浩，趙艷，沈煒

1(浙江科峰生物技術有限公司，浙江 海寧, 314423) 2(浙江工商大學，浙江 杭州, 310018)

纖維素是自然界中含量最多的一類碳水化合物，也是最廉價的可再生資源，纖維素主要存在植物細胞壁中[1]。纖維素酶是能催化水解纖維素生成葡萄糖的一類糖苷水解酶，又稱纖維素酶系[2]。纖維素酶系根據其功能的差異，主要分為三大類，分別為內切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glcanohdrolase,EG)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,BG)，它們在纖維素的水解過程中協同作用，高效降解纖維素。EG隨機水解纖維素非結晶區內部的糖苷鍵，主要產生纖維糊精和低聚糖。CBH從纖維素鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。BG水解纖維二糖和寡糖以釋放可發酵的葡萄糖[2,3]。纖維素酶廣泛應用于生物質乙醇、食品、紡織、飼料等行業，我國有豐富的纖維素資源，開發高效的纖維素酶具有重要的應用價值[4]。

纖維素酶廣泛存在于微生物中，多種產纖維素酶活性較高的微生物已被發現和工業化應用[5]。因真菌產纖維素酶系較全，分解纖維素能力較強，國內外對降解纖維素菌研究多集中于真菌，比較典型的有木霉菌屬木酶屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等[2-6]。

嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermocellum，以下簡稱嗜熱纖維梭菌,俗稱為梭熱桿菌)是一種嗜熱厭氧細菌，分泌大量纖維素酶，是目前自然界中已知的降解纖維素最高效的微生物之一，是利用纖維素生產生物能源和化學品的理想菌株[7-8]。嗜熱纖維梭菌中含有催化纖維素降解的纖維小體，它是由若干纖維素酶活性的催化單元與無催化活性的支架蛋白結合形成的復合物，其獨特的結構，使得它可以比真菌纖維素酶更緊密地結合到纖維素表面，從而高效降解底物[9-12]。嗜熱纖維梭菌產生的纖維素酶耐熱性好，但是由于熱纖梭菌是一種嚴格的厭氧菌，培養條件極其苛刻，分泌纖維素酶必須在高度厭氧的條件下進行，且酶產量相對較低，我國目前尚未實現嗜熱纖維梭菌纖維素酶的工業化生產，也很少見到有關該菌發酵產酶的工藝優化等基礎研究報道。

本文對從美國羅切斯特大學引進的嗜熱纖維梭菌進行了發酵工藝優化研究。

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)ATCC 27405菌株[13]：由美國羅切斯特大學化學工程系J. H. David Wu教授提供。

1.2 培養基

基礎培養基(g)：KH2PO41.5;K2HPO42.9;尿素2.1;MgCl2·6H2O 1.0;CaCl2·2H2O 0.15;FeSO4·7H2O 0.002 5;鹽酸胱氨酸1.0; Resazurin 2.0mg;纖維二糖5.0;嗎啉丙烷磺酸(morpholinopropane sulfonic acid，MOPS) 10.0;酵母提取物 5.0;二水檸檬酸鈉3.0。

種子培養基(g/L)：纖維二糖10，玉米漿12，檸檬酸三鉀鹽2，一水檸檬酸1.25，Na2SO41，KH2PO41，NaHCO32.5,NH4Cl 1.5，尿素5，酵母抽提物l，MgCl2·6H2O 50，FeCl2·4H2O 0.1，MgCl20.2，一水半胱氨酸鹽酸鹽1，二鹽酸吡哆胺0.02，對氨基苯甲酸0.004，D-生物素0.002，VB120.02，VB10.002，pH值自然。115 ℃濕熱滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：纖維二糖10，微晶纖維素10，玉米漿12，檸檬酸三鉀鹽2，一水檸檬酸1.25，Na2SO41,KH2PO41,NaHCO32.5,NH4Cl 1.5，尿素5，酵母抽提物1，MgCl2·6H2O 50,FeCl2·4H2O 0.1， CaCl2·2H2O 0.2，一水半胱氨酸鹽酸鹽1，二鹽酸吡哆胺0.02，對氨基苯甲酸0.004，D-生物素0.002，VB120.02，VB10.002，pH值自然。115℃濕熱滅菌20min。

1.3 纖維素酶酶活測定

酶活測定(濾紙酶活)參考文獻進行[14]。

取50 mg濾紙(剪成1 cm×6 cm的濾紙條)，加1 mL pH 4.8的 50 mmol/L檸檬酸緩沖液，加入適當稀釋含酶液(發酵上清液)0.5 mL，50℃反應1 h，加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加入20 mL去離子水，混合均勻后測定540 nm處的吸光值。空白對照對應加入500 μL檸檬酸緩沖液(50 mmol/L，pH 4.8)。以上酶活均扣除發酵液中的還原糖后計算酶活力，發酵培養基中的殘留乳糖通過高效液相色譜測定：Bio-Rad HPX-87P 色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為5 mmol/L的稀硫酸，檢測器為示差檢測器。

酶活定義為每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個活力單位。

1.4 發酵培養條件優化

1.4.1 菌株活化

采用基礎培養基進行菌株活化。將配制好的基礎液體培養基煮沸驅氧，而后用定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，每支10 mL，并插入通氮氣的長針頭以排除氧氣。此時可以清楚地看到培養基內加入的氧化還原指示劑刃天青由藍到紅最后變成無色，說明試管內已成為無氧狀態，然后，蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，121℃滅菌20 min后備用。

將嗜熱纖維梭菌接種到培養管的培養基中，然后將培養管放入60℃生化培養箱培養60 h。

1.4.2 發酵條件的探索

培養管中活化培養后的菌株接種到裝液量60 mL的100 mL厭氧培養瓶中進行下列不同發酵條件的研究。對發酵溫度、發酵培養時間、培養基初始pH值分別進行單因素試驗，尋找最適條件。

設置不同的發酵溫度，分別為30、40、50、55、60 ℃，發酵72 h，發酵結束后測定纖維素酶活。

設置不同的培養時間，分別為24、48、60、72、84、96 h，60℃培養，發酵結束后測定纖維素酶活。

設置不同的培養基初始pH，分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8，發酵結束后測定纖維素酶活。

1.5 發酵工藝探索

1.5.1 放大工藝下的纖維素酶發酵法

將活化的菌株按照2%的接種量轉接到50 mL發酵培養基，55℃恒溫培養24 h，得到一級種子液。

發酵培養基裝入5 L發酵罐，裝液量3 L，滅菌結束后，向發酵罐通入氮氣，除去培養基及罐內氧氣。調節培養pH恒定為7，罐溫控制為55℃，然后接入一級種子液，停止通氣，間歇式攪拌發酵。保持發酵罐內無氧狀態，厭氧發酵。

1.5.2 補料分批發酵制備纖維素酶

1.5.2.1 補料時間點的確定

將活化菌株接種到種子培養基中，然后以 2%的接種量接種到發酵培養基中，得到一級種子液，將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發酵培養基的5 L發酵罐中，厭氧培養，罐溫控制為55℃，調節pH為7，間歇式攪拌。根據菌體生長情況和糖耗情況，分別在發酵開始后的16、20、24 h開始向發酵體系中緩慢添加纖維二糖溶液，流速為6 mL/h，上述纖維二糖溶液質量濃度為200 g/L，比較產酶情況。

1.5.2.2 補料碳源的確定

將活化的菌株接種到種子培養基中，然后以2%的接種量接種到發酵培養基中，得到一級種子液，將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發酵培養基的5 L發酵罐中，厭氧培養，罐溫控制為55℃，調節pH為7，間歇式攪拌。發酵16～48 h，分別添加纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液，流速為6 mL/L，上述碳源溶液質量濃度為200 g/L，發酵至60 h，比較產酶情況。

2 結果與分析

2.1 發酵條件的優化結果

嗜熱纖維梭菌是嚴格厭氧菌，進行發酵條件研究時，保證發酵的無氧條件，厭氧發酵。

不同發酵溫度下的研究結果表明，嗜熱纖維梭菌在50～60℃的條件下相對酶活較高，可達90%以上，其中55℃時相對酶活力最高(圖1)。此溫度與報道的該菌的嗜熱特征和產纖維素酶的條件相似，因此，利用該菌進行發酵生產纖維素酶的最適溫度應為55℃。

圖1 發酵溫度對酶活影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on enzymatic activity

不同發酵時間的結果表明，隨著發酵時間的增加，酶活力呈上升趨勢，發酵至60 h酶活力達到峰值，96 h酶活開始下降(圖2)。所以發酵進行60 h后停止，可以大大節約發酵成本。

圖2 發酵時間對酶活影響Fig.2 Effect of fermentation time on enzymatic activity

培養基不同初始pH值的研究結果表明，當培養基初始pH為6.5～8時，相對酶活可達90%以上，最適培養基pH為7(圖3)。按照上述優化條件即在55℃，初始培養基pH為7的條件下發酵60 h，測得酶活為5.12 U/mL，為未優化的1.5倍。

圖3 培養基初始pH對酶活影響Fig.3 Effect of initial fermentation pH on enzymatic activity

2.2 發酵工藝的優化

2.2.1 放大工藝下的纖維素酶發酵法

嗜熱纖維梭菌是嚴格厭氧菌，發酵放大工藝研究時維持發酵罐內無氧條件，厭氧發酵。將保藏的菌株接種到種子培養基中，然后，以 2%的接種量接種到發酵培養基中，得到一級種子液，將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發酵培養基的5 L發酵罐中，厭氧培養，罐溫控制為55℃，調節pH為7，間歇式攪拌。發酵60 h酶活為12.37 U/mL。結果表明，發酵罐的放大培養條件下，嗜熱纖維梭菌產纖維素酶酶活顯著高于厭氧瓶條件下的酶活。

2.2.2 補料分批發酵制備纖維素酶的最佳時間

首先研究了根據嗜熱纖維梭菌生長曲線和糖耗的關系，結果表明菌體在16 h后進入指數生長期，生物量顯著增加，此時糖的利用率最大(圖4)。根據菌體生長和糖耗情況，確定了補料時間點。分別在發酵開始后的16、20、24 h開始向發酵體系中緩慢添加質量濃度為200 g/L纖維二糖溶液，流速為6 mL/h。比較產酶情況，發現0～12 h糖耗和生長情況較緩慢，進入16 h后，菌體快速生長和糖耗進入快速消耗階段，所以選擇16、20、24 h作為補料點。通過比較了不同補料時間點的產酶情況，發現從16 h的點開始補料，酶活最高，達到16.38 U/mL(表1)。發酵48 h后，菌體到達穩定期，糖耗變緩，因此，確定補料時間為16～48 h。

圖4 嗜熱纖維梭菌生長和糖耗曲線Fig.4 Curve of growth and glucose use for Clostridium thermocellum

表1 不同補料時間點對酶活影響Table 1 Effect of different time of carbon addition on enzymatic activity

2.2.3 補料分批發酵制備纖維素酶的最佳碳源

對幾種可能提高嗜熱纖維梭菌纖維素酶發酵產生酶活的碳源進行了研究。發酵16～48 h，分別添加質量濃度為200 g/L的纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液，流速為6 mL/L，發酵60 h后，測定酶活。酶活結果分析比較發現，添加纖維二糖的時候，酶活最高，達16.56U/mL(表2)。因此，纖維二糖為分批補料發酵條件下的最佳補料碳源。

表2 不同碳源對酶活影響Table 2 Effect of different carbon sources on enzymatic activity

3 結論

纖維素的分解和利用是當今世界研究熱點之一，可以用于生物基能源生產、新型生物工藝和功能產品開發等，但轉化效率很低，高效纖維素酶、纖維小體的研究和開發應用是突破瓶頸的關鍵[15-16]。纖維素酶已在轉化利用含纖維素物質生產生物燃料、食品和飼料原料加工、造紙業、紡織業等多個行業進行商業化生產和應用[17-19]。目前纖維素酶研究主要集中于真菌，但由于細菌相對真菌來說生長速率較高，所產纖維素酶的熱穩定性和堿穩定性高，用細菌產生纖維素酶的優勢正在引起更多研究者的關注[20-22]。

嗜熱纖維梭菌是嗜熱厭氧細菌，產生纖維小體，纖維素酶具有耐高溫、催化活性高等明顯的優勢[23-25],該菌產纖維素酶的培養條件探索和優化是利用其進行工業化生產的前提。嗜熱纖維梭菌是嚴格厭氧菌，工業化生產條件要求苛刻，要確保發酵罐內無氧條件，厭氧發酵。本文對該菌在發酵厭氧瓶水平上進行了發酵條件探索，發現在55℃，初始培養基pH為7、發酵60 h為最佳條件，此時測得酶活為5.12 U/mL。此外，在放大的發酵罐水平上進行了發酵工藝探索和優化，根據菌體生長情況對分批發酵條件下的補料時間和添加碳源進行了研究，放大和優化后，該菌產纖維素酶的酶活由5.12 U/mL提高到16.56 U/mL，效果極顯著。研究結果為進一步規模化的工業化生產降低成本和設計工藝提供了參考依據。