不同因素對牡蠣酶解液美拉德反應產物的影響

張滿，周亞軍，溫丑玉，徐瑞彬，曹燕峰，牛麗紅，劉海梅，趙芹

(魯東大學 食品工程學院，山東 煙臺,264025)

牡蠣作為世界第一大養殖貝類，其肉質鮮美，營養豐富，蛋白質含量高達50.6%(質量分數)，且必需氨基酸種類齊全[1]。近年來，隨著天然調味料的發展，以牡蠣為原料，酶解制備天然海鮮調味料引起了研究者的廣泛關注。劉海梅等[2]采用Protemax復合蛋白酶水解牡蠣肉，制備了具有強烈鮮美味的酶解液，其鮮味氨基酸含量達436.60 mg/100 mL。姚玉靜等[3]選用胰蛋白酶和風味蛋白酶對牡蠣進行深度酶解，也得到了鮮味特征明顯的酶解產物，其鮮味氨基酸含量為17.5%，甜味氨基酸含量為30.6%。雖然牡蠣酶解液鮮味顯著且營養豐富，但是由于牡蠣本身的腥味，導致其酶解液帶有一定的腥臭味，不僅影響了產品的風味，也制約了其在水產調味料中的使用。

美拉德反應(Maillard reaction)是食品體系中游離氨基酸、多肽或蛋白質的氨基與還原糖的羰基之間發生的一種復雜反應，它能賦予食品愉快的香味和誘人的色澤，同時減弱了食品中原有的腥味，目前已成為生產熱反應型天然肉味香精香料的主要途徑[4]。半胱氨酸(Cysteine，Cys)和硫胺素(Vitamin B1，VB1)作為重要的肉味前體化合物，可與還原糖發生美拉德反應，產生咸味、肉味和醬油樣香氣,使美拉德反應產物的風味加強[5-6]。探討肉味前體化合物對牡蠣酶解液美拉德反應產物(Maillard reaction produncts，MRPs)風味的影響，對于改善水產品酶解液的腥味問題制備、肉香風味水產調味料具有重要意義。

本文以牡蠣酶解液為氨基來源，與葡萄糖發生美拉德反應，研究L-Cys質量分數、VB1質量分數、體系初始pH以及反應時間等4個因素對MRPs的影響，優化得到最佳的美拉德反應條件，為牡蠣熱反應肉香風味調味料的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮太平洋牡蠣(Crassostreagigas)，殼長 10～15 cm：市售；Protemax復合蛋白酶(酶活力 1.5 AU/g)、風味蛋白酶(酶活力500 LAPU/g)：諾維信憶諾聯創生物科技(北京)有限公司；葡萄糖：上海市藍季生物有限公司；L-半胱氨酸鹽：南京奧多福尼生物科技有限公司；VB1：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JJ-2B型組織勻漿搗碎機，金壇市榮華儀器制造有限公司；T6型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備

將太平洋牡蠣外殼沖洗干凈后，開殼，取出全部軟組織，瀝干后稱重。取牡蠣肉按照料液比1∶5(質量比)加入蒸餾水，于高速組織搗碎機勻漿。pH 7.0下，添加Protemax復合蛋白酶(30 AU/kg)，于50 ℃下恒溫酶解2 h，沸水浴滅酶15 min。冷卻至室溫后添加風味蛋白酶(10 000 LAPU/kg)，50 ℃下恒溫酶解2 h，沸水浴滅酶15 min。酶解產物于5 000 r/min離心15 min，取上清液即為牡蠣酶解液。

1.3.2 MRPs褐變程度和反應中間產物的測定

參考文獻方法[7-8]，用紫外可見分光光度計測定294 nm的吸光度值，作為中間產物生成量的指標，測定420 nm的吸光度值表示MRPs的褐變程度，作為晚期褐變聚合物形成的指標。

1.3.3 MRPs的感官評價

感官評定小組由10人(5男5女)組成，根據表1中的評分標準對MRPs進行綜合評價，打分后取平均值。

表1 美拉德反應液風味的感官評定指標Table 1 Sensory evaluation standards of Maillard reaction products

1.3.4L-Cys質量分數對MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質量分數為8%的葡萄糖，并加入不同質量分數的L-Cys(0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)，在pH 7.0下，于100 ℃熱反應60 min，冷卻，5 000 r/min離心15 min，取上清液測定A420、A294，評價其感官特性。

1.3.5 VB1質量分數對MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質量分數為8 %的葡萄糖，并加入不同質量分數的VB1(0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)，反應過程及測定分析指標同1.3.4。

1.3.6 體系初始pH對MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質量分數為8 %的葡萄糖，0.25%的L-Cys，0.25%的VB1，分別調節體系pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，反應過程及測定分析指標同1.3.4。

1.3.7 反應時間對MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質量分數為8 %的葡萄糖，0.25%的L-Cys，0.25%的VB1，調節pH為7.0，在100 ℃下分別加熱反應30、60、90、120和150 min，測定分析指標同1.3.4。

1.3.8 數據處理

采用Excel軟件對數據進行分析處理及圖表制作。每組實驗重復3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1L-Cys質量分數對MRPs的影響

半胱氨酸作為含硫氨基酸，對肉香味化合物的生成具有不可替代的重要作用，但是其在反應中生成的中間體對美拉德反應具有一定的減緩作用。由圖1-A可知，隨著L-Cys質量分數的增加，美拉德反應體系的褐變程度持續下降，說明L-Cys的添加在一定程度上抑制了MRPs的形成。HUANG等[9]研究發現，Cys對大豆肽-木糖美拉德反應體系顏色的形成也具有顯著的抑制作用，與本文結果一致。L-Cys作為含巰基的α-氨基酸，比大部分氨基酸更易被氧化。隨著美拉德反應進行，其氧化程度增加，進而影響了吡嗪、呋喃等美拉德反應的主要產物以及其他前體物質的產生[10]。在抑制顏色生成方面，其機理可能有兩方面：一是由于Cys含有其獨特的親核基團—SH，可與α, β-不飽和羰基中間產物反應，捕獲親電子的化合物及中間產物，從而阻止褐色終產物的形成[11]；二是Cys通過阻礙加熱過程中形成大量的自由基，進而抑制了MRPs的生成[12]。

中間產物生成量和感官評分隨L-Cys質量分數增加均呈現先上升后下降的趨勢(見圖1-A和圖1-B)，主要是由于隨著質量分數增加，L-Cys在Strecker反應中產生的H2S、NH3和乙醛等活躍的反應中間物的量逐漸上升，進一步反應生成較多的肉香風味化合物[13]。但是，當質量分數高于0.25%時，L-Cys會因熱分解產生過多的氨、硫化氫等含硫物質，導致不協調的硫臭味，破壞了肉味香氣的形成。結合不同L-Cys質量分數下MRPs感官評分雷達圖(圖1-C)分析得出，L-Cys的最適質量分數為0.25%。

A-A420;B-A294;C-感官評分雷達圖圖1 L-Cys質量分數對MRPs的影響Fig.1 Effect of L-Cys addition on the formation of Maillard reaction products

2.2 VB1對MRPs的影響

VB1是一種重要的肉味前體化合物，很多含硫的肉類風味化合物，如呋喃、呋喃硫醇、噻吩、噻唑等，都可以通過VB1的熱降解產生，VB1的熱降解也會產生H2S、NH3等美拉德反應的中間物質[14]。由圖2-A和圖2-B可知，當VB1用量在0%～0.50%時，隨著VB1質量分數的增加，美拉德反應產物的感官品質明顯提升，反應生成的中間產物量也明顯增加，說明VB1質量分數適當時，對整個MRPs風味具有提升和協調作用。當用量在0.50%～1.00%時，感官評分隨著VB1質量分數的增加反而降低，中間產物的含量也呈現下降趨勢，一方面的原因可能是VB1的降解產物抑制了美拉德反應繼續進行，另一方面可能是過量的VB1添加導致H2S、NH3等硫臭味物質產生，掩蓋了原來的肉香味[15-16]。

由圖2-A可知，當用量在0%～0.75%時美拉德反應體系的色澤隨VB1質量分數的增加而減弱，說明VB1在一定濃度內有降低褐變程度的作用。VB1對色澤形成的抑制作用可能與含硫化合物如亞硫酸鹽的抑制機制相似，即硫離子通過結合糖基胺的裂解產物從而阻斷發色團的生成，抑制高級美拉德反應產物類黑精的形成[17]。當VB1用量在0.75%～1.00%時，褐變程度有所上升，這可能是由于VB1質量分數過大時受熱發生降解，噻唑環中C-N及C-S鍵的斷裂，形成了非常重要的硫基酮中間產物―羥甲基硫基酮，由此產生一系列呈色的含硫雜環化合物[18]。結合MRPs的感官評分雷達圖(圖2-C)分析得出，VB1的最適質量分數為0.50%。

A-A420;B-A294;C-感官評分雷達圖圖2 VB1質量分數對MRPs的影響Fig.2 Effect of VB1 addition on the formation of Maillard reaction products

2.3 體系初始pH對牡蠣酶解液美拉德反應效果的影響

體系初始pH對MRPs的影響如圖3所示。在pH 4.0～9.0，褐變程度與中間產物的量逐漸增加，感官評分隨pH上升呈先增加后降低的趨勢(圖3-A和圖3-B)。由此可見，初始pH值太低或者太高都會影響牡蠣美拉德反應液的整體風味，其原因與不同pH下美拉德反應速率有關。在pH≤7.0時，美拉德反應程度較弱，在強酸性條件下氨基被質子化，阻止了葡基胺的形成，進而阻礙了美拉德反應的進程。當體系呈堿性時，美拉德反應速率提高，氨基氮將嚴重損失，因此褐變程度和中間產物的量迅速增加，但同時也導致反應液產生的風味變差[19]。另外，在有含硫化合物參與的美拉德反應體系中，偏酸時產生的H2S易逸出體系，偏堿時NH3則易逸出，而當反應體系缺少H2S和NH3時，都不能形成理想的肉香味[20]。結合感官評分(圖3-C)分析，體系初始pH值在7.0時，MRPs形成良好的風味，此結果與袁林等[21]的研究結果趨勢一致。

A-A420;B-A294;C-感官評分雷達圖圖3 初始pH對MRPs的影響Fig.3 Effect of pH on the formation of Maillard reaction products

2.4 反應時間對MRPs的影響

隨著反應時間的延長，反應液中的氨基酸與還原糖不斷地發生反應，會形成大量的類黑精色素[22]。由圖4可知，在0～120 min隨著反應時間的延長，褐變程度、感官評分和中間產物生成量均增加，美拉德反應程度逐漸增大。當反應時間超過120 min后，褐變程度和中間產物生成量繼續增加，但是感官評分開始下降，可能是由于過量產生的類黑精經過環化生成一系列吡啶、吡咯等含氮雜環化合物，產生的焦香味和雜氣給MRPs帶來不良風味[16]。綜合感官評分雷達圖(圖4-C)分析得出，美拉德反應最適宜的時間為120 min。

A-A420;B-A294;C-感官評分雷達圖圖4 反應時間對MRPs的影響Fig.4 Effect of reaction time on the formation of Maillard reaction products

2.5 美拉德反應條件的正交優化

依據單因素試驗結果，設計正交試驗L9(34)，優化美拉德反應條件。正交試驗的因素水平設計如表2所示，試驗結果如表3所示。

表2 美拉德反應因素水平表Table 2 The factor levels of Maillard reaction factors

由表3可知，對A420而言，4個因素對MRPs影響的大小順序為C>A>D>B，即體系初始pH>L-Cys質量分數>反應時間>VB1質量分數，由極差分析和各因素平均值可得優化后適宜的反應條件為L-Cys質量分數0.15%，VB1質量分數0.50%，pH 8.0，反應時間130 min；對A294而言，4個因素對MRPs影響的大小順序為A>D>B>C，即L-Cys質量分數>反應時間>VB1質量分數>體系初始pH，由極差分析和各因素平均值可得優化后適宜的反應條件為L-Cys質量分數0.15%，VB1質量分數0.50%，pH 8.0，反應時間130 min；對感官評分而言，各因素對MRPs影響的大小順序為A>B>C=D，即L-Cys質量分數>VB1質量分數>體系初始pH=反應時間，由極差分析和各因素平均值可得優化后適宜的反應條件為L-Cys質量分數0.15%，VB1質量分數0.75%，pH 8.0，反應時間為110或120 min。由極差分析可知，VB1質量分數在0.50%和0.75%時的色澤和風味差異不大，考慮到經濟成本，選用0.50%的質量分數。綜合以上分析，優化得到美拉德反應最佳工藝條件為L-cys質量分數0.15 %、VB1質量分數0.50 %、pH 8.0、反應時間130 min。

表3 Maillard反應正交試驗結果Table 3 The results of the orthogonal optimization in Maillard reaction

2.6 美拉德反應驗證試驗

在正交優化得出的最佳組合條件下進行美拉德反應，得到的MRPs的A420為0.672，A294為0.853，感官評分為4.67，無腥味且具有良好的肉香味。

3 結論

本文以牡蠣酶解液與葡萄糖建立美拉德反應體系，通過單因素試驗比較了L-Cys質量分數、VB1質量分數、體系初始pH和反應時間對MRPs的影響，并利用正交試驗L9(34)優化得到最佳的美拉德反應條件為L-Cys質量分數0.15%、VB1質量分數0.50%、體系初始pH為8.0、反應時間130 min。在此條件下，得到的美拉德反應液感官評分最高，無腥味，鮮味濃郁且具有良好的肉香味。本研究為水產品酶解液風味的改善提供了良好的思路，也為新型牡蠣調味品的研究及開發利用提供了參考。