高效液相色譜法測定蔗糖-6-乙酯

楊欣宜，郭輝*，陳云菲，錢俊青，莊勇

1(浙江工業大學，浙江 杭州，310000)2(南通市常海食品添加劑有限公司，江蘇 南通，226000)

三氯蔗糖是一種甜度高、無熱量的甜味劑[1]，它不被人體吸收，可供肥胖、糖尿病患者食用，是一種保健型的優質調味劑[2]。三氯蔗糖的制備過程較為復雜，包括合成蔗糖-6-乙酯，氯化和脫乙酰化[3]。其中蔗糖-6-乙酯是單基團保護法制備三氯蔗糖的重要中間體[4]。由于蔗糖-6-乙酯衍生物很多，同時這類成分基本沒有紫外吸收，如何對其進行定性定量的分析一直是亟需解決的問題。

薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[5-8]是定性定量檢測蔗糖-6-乙酯的常用分析方法。薄層色譜法很早便用于蔗糖酯的分析，并且應用廣泛，有文獻報道以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=3∶2為展開劑成功監測了蔗糖-6-乙酯的反應進程[9]。喻理德等[10]采用V(丙酮)∶V(乙酸乙酯)∶V(冰醋酸)∶V(DMF)=4∶5∶0.5∶0.5)作展開劑，50 %的甲醇硫酸液作顯色劑，在115℃下烘干顯色，結果表示該法能較好地分離6-位及4-位蔗糖乙酸酯。薄層色譜法操作快速簡便，但由于蔗糖酯本身不顯色，需要配制顯色劑，并且合成蔗糖-6-乙酯過程中有較多副產物，薄層色譜法難以將其很好地分離，需要其他的方法有效分離產物[11]。目前，對蔗糖-6-乙酯的檢測以高效液相色譜法為主，用于蔗糖-6-乙酯的合成分析的檢測器有示差折光檢測器(refractive index detector,RID)和蒸發光散射檢測器(evaporative light scattering detector,ELSD)。李明華等[12]利用高效液相色譜法檢測在離子介質中反應的蔗糖-6-乙酯，采用示差檢測器，以C18(250 mm×4.6 mm×5 μm為色譜柱，V(甲醇)∶V(水)=70∶30為流動相，定量檢測了蔗糖-6-乙酯含量。陸正清等[13]制備了蔗糖-6-乙酯并用高效液相色譜進行檢測，采用C18反相色譜柱，V(乙腈)∶V(水)=15∶85作流動相，準確測定了蔗糖-6-乙酯的含量并由此計算產率。相較于示差折光檢測器，蒸發光散射檢測器更穩定，靈敏度更高，不需要復雜的樣品制備，且可梯度洗脫。目前采用蒸發光散射檢測器分析蔗糖-6-乙酯的文獻較少，無分析方法研究文獻。為了找到方便、準確的測定方法，本試驗采用HPLC-ELSD建立了蔗糖-6-乙酯含量的測定方法，并對外標法與內標法進行了比較。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

固定化疏棉狀噬熱絲孢菌脂肪酶(TLIM酶)，250 IUN/g，諾維信生物技術有限公司；蔗糖八乙酸酯(分析純，純度為98 %)，阿拉丁試劑有限公司；蔗糖-6-乙酯(純度>95 %)，實驗室自制[14]；甲醇、乙腈為色譜純，Sigma；蔗糖、乙酸乙烯酯、叔戊醇、二甲基亞砜均為化學純，國藥集團化試劑有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Alltech 3300蒸發光散射檢測器，美國Grace公司；HH-4水浴恒溫振蕩器，金壇市江南儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

稱取10.3 g蔗糖(0.3 mol/L)、25.8 g(3 mol/L)乙酸乙烯酯、4 g TLIM酶、1 g 4A分子篩于250 mL具塞三角瓶中，再加入(V(叔戊醇)∶V(二甲基亞砜)=83∶17)溶劑，置于恒溫搖床中，30 ℃、180 r/min的條件下反應16 h。反應結束后，反應液在3 500 r/min的條件下離心10 min，取上清液，進液相分析，每組3個平行。

1.2.2 高效液相色譜條件的選擇

高效液相色譜法是一種較為普遍的分析方法，其分離度好、檢測靈敏度高、方便快捷，通常與紫外檢測器或示差折光檢測聯用[15]。由于蔗糖與蔗糖酯不含發色團，因此用紫外檢測器無法檢測分離；示差折光檢測器雖然對糖類的檢測較為靈敏，但其容易受溫度與流動相的影響，并且不適用于梯度洗脫。蒸發光散射檢測器是近年來使用廣泛的通用型檢測器，其能檢測不含發色團的化合物，適用于梯度洗脫，并且成本低、操作簡單、不受溫度影響[16]。有文獻報道糖類更適合用ELSD進行檢測，其靈敏度高于示差折光檢測器[17]。通過先前試驗室的研究基礎得知[18]，蔗糖-6-乙酯的檢測采用ELSD，并以水作流動相，可以在20 min內將產物和試劑洗脫。

因此本試驗以HPLC-ELSD對蔗糖-6-乙酯進行檢測，依次對色譜柱、流動相、柱溫條件進行選擇，以確定最佳HPLC分析條件。

1.2.3 外標法

1.2.3.1 線性考察

精密稱取蔗糖-6-乙酯自制對照品，分別用叔戊醇配制成濃度為1.10、1.84、2.21、2.76、3.64、5.52、8.27、11.03 g/L的蔗糖-6-乙酯樣品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，依次在選定的色譜條件下進樣(每個樣品重復測定3次)，考察蔗糖-6-乙酯峰面積及其對應的濃度的關系。

1.2.3.2 精密度考察

取同一份供試品溶液，在所建立的色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.3.3 重復性考察

取同一樣品溶液6份，按供試品制備方法進行制備，在所建立的色譜條件下測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.3.4 穩定性考察

取同一份供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.3.5 檢出限和定量限

LOD定義為S/N=3時對應的待分析濃度，LOQ定義為S/N=10 時對應的待分析濃度。

制備濃度為0.55 g/L的對照品溶液，并取12份進行測定，分別記錄其響應值，如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

1.2.4 內標法

色譜條件：檢測器：ELSD；色譜柱：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；梯度洗脫流動相：0～8 min,5%甲醇，9～12 min,30%甲醇，13～22 min,75%甲醇；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。蒸發光檢測器溫度：85 ℃；氮氣流速：1.5 L/min。

樣品溶液制備：稱取0.02 g蔗糖八乙酸酯，用樣品溶液溶解并定容至10 mL。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，再經HPLC分析。

1.2.4.1 線性考察

稱取蔗糖-6-乙酯對照品和0.02 g蔗糖八乙酸酯，分別用叔戊醇配制成濃度為1.10、1.84、2.21、2.76、3.64、5.52、8.27、11.03 g/L的對照品溶液。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，依次在選定的色譜條件下進樣(每個樣品重復測定3次)，考察各樣品的峰面積及其對應的濃度的關系。

1.2.4.2 精密度考察

取同一份制備好的樣品溶液，在所建立的色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.4.3 重復性考察

取同一樣品6份，按制備方法進行制備，在所建立的色譜條件下測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.4.4 穩定性考察

取同一份樣品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.4.5 檢出限和定量限

稱取0.02 g蔗糖八乙酸酯，制備濃度為0.55 g/L的對照品溶液，并取12份進行測定，分別記錄其響應值。按式(1)、(2)計算。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

選定HPLC條件為：檢測器：ELSD；流動相：V(甲醇)∶V(水)=10∶90；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。蒸發光檢測器溫度：85℃；氮氣流速：1.5 L/min。分別考察ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)、ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)對分離效果的影響。由圖1可以看到，采用ZORBAX SB-C18、Eclipse XDB-C18、Extend-C18柱的色譜圖中蔗糖多酯峰形矮胖、分離效果不好，而ZORBAX SB-Aq柱不僅對蔗糖、蔗糖-6-乙酯和蔗糖多酯的分離效果都較好，并且保留時間較短，因此選擇ZORBAX SB-Aq進行后續試驗。

圖1 不同色譜柱下的蔗糖-6-乙酯HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sucrose-6-acetate under different columns

2.1.2 流動相的選擇

選定HPLC條件為：檢測器：ELSD；色譜柱：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。蒸發光檢測器溫度∶85℃；氮氣流速：1.5 L/min。對V(甲醇)∶V(水)=5∶95、V(甲醇)∶V(水)=10∶90、V(甲醇)∶V(水)=15∶85、V(甲醇)∶V(水)=20∶80、V(甲醇)∶V(水)=30∶70六種流動相系統進行考察。由圖2可以看到，隨著流動相極性減小，保留時間變短，但各組分距離變近，分離度變小，分離效果不好。但考慮超純水保留時間較長，最后選擇V(甲醇)∶V(水)=5∶95為流動相，來進行后續試驗。

圖2 不同流動相下的蔗糖-6-乙酯HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sucrose-6-acetate in different mobile phases

2.1.3 柱溫的選擇

在2.1.2的試驗條件下，分別考察柱溫為：20、25、30、35、40 ℃時對分離效果的影響。如圖3所示，隨著溫度的升高，蔗糖保留時間不變，蔗糖-6-乙酯保留時間變短，蔗糖多酯保留時間變長，同時蔗糖多酯的峰在30 ℃時分離效果較好，因此綜合考慮最終選擇柱溫為30 ℃，進行后續試驗。

圖3 不同柱溫下的蔗糖-6-乙酯HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sucrose-6-acetate in different mobile phases

2.1.4 色譜條件的確定

樣品的分離色譜圖如圖4所示。蔗糖保留時間為3.732 min，蔗糖-6-乙酯保留時間為7.143 min，蔗糖多酯保留時間為17.272 min。

圖4 蔗糖-6-乙酯樣品色譜圖Fig.4 Sucrose-6-acetate sample chromatogram

2.3 外標法

2.3.1 線性考察

將不同濃度樣品溶液進行HPLC分析，由于蒸發光散射檢測器響應值與濃度關系較為復雜，查閱相關文獻發現糖類或糖酯類的ELSD分析采用的線性關系主要有2種：濃度與峰面積直接作線性回歸、濃度的對數與峰面積的對數作線性回歸[15, 19-20]。于是對兩種線性關系進行了比較，結果如圖5所示。

a-濃度對數與峰面積對數線性回歸圖；b-濃度與峰面積線性回歸圖圖5 外標法測定蔗糖-6-乙酯標準曲線圖Fig.5 Standard curve of sucrose-6-ethyl by external standard method

結果表明將濃度與峰面積直接進行線性回歸關系更加良好。圖5表明，在1.10～11.03 g/L，蔗糖-6-乙酯質量濃度與其峰面積呈現良好的線性關系，回歸方程為A=2 427.8C-3 355.4，相關系數為R2=0.994。

2.3.2 精密度考察

取同一份樣品溶液，在優化的色譜條件下連續進樣6次，測得6次試驗結果如表1所示，RSD<3.0 %，表明該方法精密度好。

表1 外標法測定蔗糖-6-乙酯精密度結果Table 1 Determination of the precision of sucrose-6-acetate by external standard method

2.3.3 重復性考察

取同一樣品6份，按供試品制備方法進行制備，在所建立的色譜條件下測定，測得試驗結果如表2所示，RSD<2.0 %，表明該方法重現性良好。

表2 外標法測定蔗糖-6-乙酯重復性結果Table 2 Determination of the repeatability of sucrose-6-acetate by external standard method

2.3.4 穩定性考察

取同一份供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，對含量的變化情況進行計算分析，結果如表3所示。由表可知，其RSD<2.0 %，說明在24 h內該檢測方法穩定可靠。

表3 外標法測定蔗糖-6-乙酯穩定性結果Table 3 Determination of the stability of sucrose-6-acetateby external standard method

2.3.5 檢出限和定量限

將12份濃度為0.55 g/L的樣品進行測定，記錄峰面積，計算得到LOD=53.05 μg/mL，LOQ=176.83 μg/mL。

2.4 內標法

樣品與內標的分離色譜圖如圖所示。蔗糖保留時間為3.796 min，蔗糖-6-乙酯保留時間為6.856 min，蔗糖多酯保留時間為10.630 min，蔗糖八乙酸酯保留時間為17.813 min。

圖6 內標法測定蔗糖-6-乙酯樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of sucrose-6-acetate sample by internal standard method

2.4.1 線性考察

將不同濃度樣品溶液進行HPLC分析，分別作了濃度與峰面積的線性回歸和濃度對數與峰面積對數的線性回歸(圖7)。

a-濃度對數與峰面積對數線性回歸圖；b-濃度與峰面積線性回歸圖圖7 內標法測定蔗糖-6-乙酯標準曲線圖Fig.7 Standard curve of sucrose-6-ethyl by internal standard method

經過比較濃度與峰面積的線性關系和濃度的對數與峰面積的對數的線性關系，結果表明，將濃度與峰面積直接進行線性回歸關系更加良好。在1.10～11.03 g/L，蔗糖-6-乙酯質量濃度與其峰面積呈現良好的線性關系，回歸方程為A=1 197.5C-525.75，相關系數為R2=0.996 1。

2.4.2 精密度考察

取同一份樣品溶液，在內標法色譜條件下連續進樣6次，測得6次試驗結果如表4所示，RSD<1.0 %，表明該內標法精密度很好。

表4 內標法測定蔗糖-6-乙酯精密度結果Table 4 Determination of the precision of sucrose-6-acetateby internal standard method

2.4.3 重復性考察

取同一樣品溶液6份，按制備方法進行制備，在內標法色譜條件下測定，測得試驗結果如表5所示，RSD 1.0 %，表明該方法重復性良好。

表5 內標法測定蔗糖-6-乙酯重復性結果Table 5 Determination of the repeatability of sucrose-6-acetate by internal standard method

2.4.4 穩定性考察

取同一份樣品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，對樣品含量的變化情況進行計算分析，結果如表6所示。RSD<2.0 %，說明在24 h內該檢測方法穩定可靠。

表6 內標法測定蔗糖-6-乙酯穩定性結果Table 6 Determination of the stability of sucrose-6-acetateby internal standard method

2.4.5 檢出限和定量限

將12份質量濃度為0.55 g/L的對照品任溶液進行測定，記錄峰面積，計算得到LOD=31.04 μg/mL，LOQ=103.46 μg/mL。

3 結論

本文對蔗糖-6-乙酯的檢測分析方法進行了條件優化，建立了能夠快速準確測定蔗糖-6-乙酯的高效液相色譜-蒸發光散射檢測方法(HPLC-ELSD)。首次對檢測蔗糖-6-乙酯所建立的分析方法進行了方法學驗證，得到較好的結果。同時通過HPLC-ELSD進行內標法和外標法檢測，并對兩種方法進行比較，結果表明2種方法各項指標都能滿足試驗室要求。其中外標法無需前處理，可以通過標準曲線直接計算含量，更簡便快速；相比較而言，內標法可以一定程度上抵消大多外界條件的影響，因而更準確，而且內標法可以在無標準品情況下進行檢測，優越性更高。因此可以根據試驗室條件與需求對兩種方法進行選擇。與現有的檢測蔗糖-6-乙酯的分析方法相比，本文所建立的分析方法穩定、快捷、方便、準確，并且所做的方法學驗證確保了該分析方法的可靠性，為蔗糖酯的檢測分析提供了參考。