5-羥色胺通過上調2B受體抑制放線菌素D誘導肝細胞凋亡初步實驗研究

馬麗霞 高玉娟 劉曉慧 張晶

肝細胞凋亡參與了多種急慢性肝臟疾病的發生、發展過程，如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、膽汁淤積性肝病和肝臟缺血-再灌注損傷等，是肝細胞損傷的重要機制之一[1-2]。體內和體外實驗發現， Fas配體、腫瘤壞死因子-ɑ、放線菌D(actinomycin D，AcD)、干擾素、四氯化碳等常見的肝毒性藥物可誘導肝細胞發生凋亡[3]。隨著研究的深入，相繼發現N-乙酰半胱氨酸、蛋白水解酶抑制劑、角質細胞生長因子等，可抑制肝細胞凋亡的發生[4-5]，但其作用機制尚未完全闡明，且臨床應用還很少。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作為一種神經遞質的小單胺分子，對肝臟的病理生理起著至關重要的作用，它可以促進多種嚙齒動物部分肝切除術后的肝臟再生，促進缺血/再灌注損傷后的肝組織修復[6，7]。研究發現，5-HT還能夠通過抑制小鼠肝細胞凋亡，改善對乙酰氨基酚誘導的肝損傷[8]。肝細胞損傷與細胞凋亡的關系非常密切。到目前為止，5-HT在AcD誘導的肝細胞凋亡過程中的作用尚不清楚。本研究探討5-HT在AcD誘導的肝細胞凋亡過程中的作用及其可能的機制，為臨床應用5-HT制劑治療肝臟疾病提供依據。

材料與方法

一、細胞、材料和試劑

人肝癌細胞系HepG2細胞和正常細胞系7702細胞(美國ATCC公司)；DMEM培養基、1640培養基和胎牛血清(美國Hyclone公司)，AcD、5-HT、MTT工作液(美國Sigma公司)，5-HT 2A受體激動劑2，5-二甲氧基4一碘苯基丙烷(2，5-dimethoxy 4-iodophenyl- 2-aminopropane，DOI)、5-HT 2B受體激動劑α-甲基血清素馬來酸鹽(α-Methylser otoninmal- eate salt，M110)、5-HT 2B受體拮抗劑N-1-甲基-5-吲哚基-5-三唑基(N-1-methyl-5-indolyl -5-isothazolyl urea，SB204)(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC流式檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；TUNEL試劑盒(德國羅氏公司)；抗肌動蛋白(β-actin)(立陶宛Fermentas公司)；PVDF膜(美國Bio-Rad公司)；兔抗人蛋白水解酶3(proteolytic enzymes 3，caspase3)單克隆抗體、DAPI熒光染料(美國Abcam公司)；兔抗人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)單克隆抗體、兔抗人磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphorylation serine/threonine protein kinase， p-AKT)單克隆抗體(美國Epitomics公司)。

二、細胞培養及藥物處理

含10%胎牛血清的DMEM培養基培養HepG2細胞，10%胎牛血清的1640培養基培養7702細胞，分別在37℃、體積分數為0.05的CO2恒溫培養箱中培養。選取一部分對數期的兩種細胞，即傳代后細胞密度生長至80 %左右時，Hank′s液洗滌細胞，加入少量0.25%胰酶消化1～2 min，分別加入各自培養基輕柔吹打成單個，細胞計數后取1.5×105個細胞鋪種于6孔板中，培養體系為2 mL，孵育24 h細胞貼壁生長后，棄去原培養基，分別換為2 mL無血清培養基，各加入25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD，每組3個復孔，分別孵育24 h后收集細胞為第1.1部分。將另一部分37℃、體積分數為0.05的CO2條件下孵育的處于對數生長期的HepG2細胞消化吹散后細計數，取1.5×105個細胞鋪于6孔板內，孵育過夜待細胞貼壁后改為無血清培養，每孔加入50 ng/mL AcD預處理30 min后，分別給予100 μmol 5-HT、100 μmol 5-HT 2B受體激動劑M110、100 μmol 5-HT 2A受體激動劑DOI、100 μmol 5-HT 2B受體拮抗劑SB204+100 μmol 5-HT，每組6個復孔，各孵育24 h后收集細胞為第1.2部分。

三、細胞凋亡檢測

采用AnnexinV-FITC/PI流式細胞術檢測，取1.1和1.2部分收集的各組細胞置于15 mL離心管，1 000 r/min(r=13.5 cm)離心5 min，棄上清；用4℃預冷的1×PBS洗滌細胞2次，每次洗滌后，1 000 r/min(r=13.5cm)離心5 min；棄上清，用1×PBS重懸細胞并計數；取1.5×105個重懸細胞，放入新的流式管中，1 000 r/min(r=13.5 cm)離心5 min，棄上清；每管加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min；1 000 r/min(r=13.5 cm)離心5 min，棄上清，每管加入190 μL Annexin V-FITC結合液，再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。上流式細胞儀檢測：每實驗組收集細胞1.5×105個，不足1.5×105個細胞組收集全部，FL1為FITC，FL2為PI，上機檢測。

四、細胞凋亡形態學檢測

采用TUNEL法，取1.1部分收集的各組細胞分別加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，盡量使細胞單層吸附到載玻片上，甲醛固定30 min，PBS浸洗2次，每次5 min。將吸附細胞的載玻片在0.2% Triton X-100中處理15 min，PBS浸洗2次。參照TUNEL試劑盒說明書制備TUNEL反應混合液，將TdT與熒光素標記的dUTP液按1∶10比例混勻，將反應液滴加適量于細胞上，37℃孵育1 h，加入50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片避光后37℃反應30 min，使用二氨基聯苯胺(DAB)將TUNEL陽性細胞染色并用蘇木精復染色，顯微鏡下觀察結果并拍照記錄。

五、細胞存活率檢測

采用MTT法，①取一部分處于對數期的HepG2和7702細胞吹打成單個后細胞計數，取5×103個細胞鋪種于96孔板中，培養體系為200 μL，孵育24 h細胞貼壁生長后，棄去原培養基，分別換為200 μL無血清DMEM培養基和1640培養基，各加入25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD，每組3個復孔，分別孵育24 h。②取另一部分處于對數生長期的HepG2細胞消化吹散后細計數，5×103個細胞鋪種于96孔板中，培孵育過夜待細胞貼壁后改為無血清培養，每孔加入50 ng/mL AcD預處理30 min后，分別給予100 μmol 5-HT 、100 μmol 5-HT 2B受體激動劑M110、100 μmol 5-HT 2A受體激動劑DOI、100 μmol 5-HT 2B受體拮抗劑SB204+100 μmol 5-HT，每組6個復孔，各孵育24 h。向以上兩部分的細胞中各加入20 μL 5 mg /mL MTT，37℃溫育5 h。棄上清，每孔加入DMSO溶液150 μL溶解沉淀，振蕩器振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光值并記錄結果。

六、細胞蛋白表達檢測

采用蛋白質印跡法，取1.2部分收集的各組細胞，根據蛋白提取試劑盒說明書步驟提取蛋白，消化、離心收集處理，加入裂解液于4℃冷庫搖床上裂解20 min，12 000 r/min (r=13.5 cm)4℃離心20 min，提取上清液即為蛋白溶液。BCA法進行蛋白定量，將蛋白濃度調節到8 μg/μL，分裝后-80℃保存，避免反復凍融。配置SDS-PAGE凝膠，分離蛋白后轉至PVDF膜上，用相應的第一抗體孵育(兔抗人caspase3單抗、AKT單抗、p-AKT單抗比例均為1∶1 000，β-actin比例為1∶2 000)，TBST洗滌后用再加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1∶5000)，化學發光試劑(ECL)顯影，以β-actin為內參照。

七、統計學分析

結 果

一、不同濃度AcD處理HepG2細胞和7702細胞凋亡率和存活率的比較

Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測結果顯示不同濃度AcD分別處理HepG2細胞和7702細胞24 h后均可誘導細胞凋亡率增加，且細胞凋亡率均隨著AcD濃度的升高而升高，其中50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD組細胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。 MTT檢測結果顯示兩種細胞存活率均隨著AcD濃度的升高而降低，其中50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD組細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。TUNEL法測定細胞DNA的片段化，結果可見50 ng/mL AcD組相比無血清對照組有更多的DNA片段化(圖1)，表明細胞凋亡增加。因此，研究表明，AcD能夠以濃度依賴的方式促進HepG2和7702細胞的凋亡。

表1 不同濃度AcD處理HepG2細胞和7702細胞凋亡率的比較(±s)

注：統計值為各組與無血清對照組相比較

表2 不同濃度AcD處理HepG2細胞和7702細胞存活率的比較(±s)

注：統計值為各組與無血清對照組相比較

圖1TUNEL法檢測HepG2細胞的凋亡 A 無血清對照組 B 50 ng/mL AcD處理組

二、5-HT和5-HT 2B受體激動劑抑制AcD誘導的HepG2細胞凋亡

Annexin V-FITC/PI流式細胞術結果顯示，50 ng/mL AcD處理HepG2細胞24 h后的凋亡率為31.96% ±2.13%，5-HT可使50 ng/mL AcD預處理HepG2細胞的凋亡率降至10.24% ±2.59%(t=1.62，P<0.05)，5-HT 2B受體激動劑M110與5-HT作用相似，使凋亡率降至8.41%±0.96%(t=1.75，P<0.05)，而5-HT 2A受體激動劑DOI使細胞凋亡率上升至32.46%±0.41%(t=1.23，P>0.05)。反之，5-HT 2B受體拮抗劑SB204能拮抗5-HT的抗凋亡作用，其凋亡率為25.92%±1.33%(t=1.45，P>0.05)。MTT法檢測以上各組細胞存活率，結果發現單用50 ng/mL AcD處理HepG2細胞24 h后細胞存活率為75.0%±2.96%，而5-HT、5-HT 2B受體激動劑M110使細胞存活率分別升至88.10%±3.16%(t=1.33，P<0.05)、84.97%±3.22%(t=1.28，P<0.05)，而DOI組、5-HT+SB204組分別為70.95%±4.11%(t=1.33，P>0.05)、72.10%±2.8%(t=1.29，P>0.05)。蛋白質印跡法檢測活化caspase3的表達，結果顯示50 ng/mL AcD處理HepG2細胞后活化caspase3的表達較無血清對照組明顯增多(t=1.45，P<0.05)，以單用AcD組為對照，5-HT和5-HT 2B受體激動劑M110使HepG2細胞活化caspase3的表達明顯減少(5-HT 組t=0.45，M110組t=0.67，均P<0.05)，而加入5-HT 2A受體激動劑DOI、5-HT 2B受體拮抗劑SB204+ 5-HT的活化caspase3表達均較AcD組差異無統計學意義(DOI組t=0.22，SB204組t=0.35，P>0.05)(圖2)。以上結果均提示100 μmol 5-HT及100 μmol 5-HT 2B受體激動劑M110均能夠抑制AcD誘導的HepG2細胞凋亡，提高細胞存活率。

注：1.無血清對照組；2. AcD組；3. AcD+5-HT組；4. AcD + M110組；5. AcD+DOI組；6. AcD+5-HT+SB204組

圖2蛋白質印跡法檢測不同處理組HepG2細胞活化caspase3的表達

三、5-HT抗凋亡作用的信號傳導通路

蛋白質印跡法檢測不同處理組的AKT和p-AKT蛋白表達，結果顯示各組的AKT蛋白表達總量相當，和單用AcD組相比，5-HT組和5-HT 2B受體激動劑M110組p-AKT蛋白表達增多(t=0.26，P<0.05)，而5-HT 2B受體拮抗劑SB204組p-AKT蛋白表達量較單用AcD組差異無統計學意義(t=0.11，P>0.05)，以上提示5-HT能夠促進AKT磷酸化，并且5-HT引起的AKT磷酸化可被5-HT 2B受體拮抗劑SB204所拮抗，提示該途徑可能是通過5-HT 2B受體所介導(圖3)。

注：1.無血清對照組；2. AcD組；3. AcD+5-HT組；4. AcD + M110組；5. AcD+DOI組；6. AcD+5-HT+SB204組

圖3蛋白質印跡法檢測不同處理組AKT和p-AKT蛋白的表達

討 論

本研究發現，5-HT能夠抑制AcD誘導的肝細胞凋亡，5-HT和5-HT 2B受體激動劑M110可以促進肝細胞AKT的磷酸化，并且此作用可以被5-HT 2B受體拮抗劑SB204所拮抗。表明5-HT很有可能通過5-HT 2B受體介導激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT信號通路，使肝細胞凋亡減少。

研究表明，肝炎(病毒性、內毒素性、藥物性)、肝缺血再灌注損傷、肝硬化、肝腫瘤等肝臟疾病均與肝細胞凋亡有關，抑制肝細胞凋亡可以改善這些肝臟疾病[2]。隨著研究的深入，現已發現多種凋亡抑制劑可保護肝細胞。Wang等[9]發現，生長激素可以抑制小鼠肝細胞凋亡。N-乙酰基-血清素可通過線粒體途徑保護H2O2誘導的HepG2細胞凋亡，N-乙酰半胱氨酸可抑制線粒體膜磷脂酶的活性從而抑制肝細胞的凋亡[10，11]。但這些藥物發揮抗凋亡作用的具體分子機制尚不十分明確，目前許多藥物研究還停留在實驗室階段。

5-HT是一種具有多種生理功能的物質，除了作為神經遞質以外，還參與血管收縮、炎癥反應、血液凝固等多種生理反應。在肝臟中，5-HT參與了肝纖維化、肝臟血流調節、肝細胞和膽管細胞的再生、肝細胞凋亡等多種生理過程[6-7]。近年來，5-HT作為一種新的抗凋亡因子被越來越多的用于各種體外的研究，Soll等[12]發現，5-HT保護血清剝奪引起的HepG2細胞的自噬。

5-HT受體共有7種，含14個亞型，其中5-HT2A、2B受體參與細胞增殖和凋亡。研究證實，肝細胞、竇狀內皮細胞表達5-HT 2A、2B受體，膽管細胞表達5-HT 2B受體[13]，另有研究報道，5-HT 2受體阻斷劑也能夠抑制鎘誘導的大鼠肝組織凋亡[14]。本研究發現，5-HT能夠使AcD誘導的肝細胞凋亡率降低，存活率增加，減少caspase3的活化，起到抗肝細胞凋亡的作用。為了進一步確定受體的類型，研究了5-HT 2A受體激動劑DOI，5- HT 2B受體激動劑M110，結果顯示5-HT 2B受體激動劑M110同樣也可以顯著抑制AcD誘導的肝細胞凋亡，而5-HT 2A受體激動劑DOI可增加AcD誘導的肝細胞凋亡，因此推斷5-HT抗肝細胞凋亡作用可能與5-HT 2B受體有關，本研究進一步通過5-HT 2B受體拮抗劑SB204能夠對抗5-HT的抑制凋亡作用來證實這一結論。

目前公認的肝細胞凋亡信號通路主要包括細胞膜死亡受體通路和細胞色素C釋放、caspase激活的線粒體通路，即外源性途徑和內源性途徑[15-16]。在眾多凋亡信號通路中，PI3K信號通路參與增殖、分化和凋亡等多種細胞功能的調節，PI3K/AKT信號傳導通路在抗凋亡機制中發揮重要作用也已為諸多實驗所證實[17-18]。PI3K激活后，質膜上產生第二信使3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatid- ylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白AKT結合導致AKT的活化。AKT又稱為蛋白激酶B(protein knlase，BPKB)，是一種相對分子質量為60 000的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其作為PI3K的下游靶蛋白是一種多功能調節因子，激活后能直接磷酸化多種轉錄因子，如激活κB激酶、Bcl-2、Bax蛋白，或者抑制P53和caspase酶，通過調控這些轉錄因子，可以抑制凋亡基因的表達和增強抗凋亡基因的表達，起到抗凋亡作用。有研究發現，AcD誘導7702細胞凋亡的機制可能為其與PI3K/AKT通路上的某一蛋白結合，從而阻斷AKT蛋白磷酸化及其活性[19]。為了進一步研究信號通路，檢測了AKT和p-AKT的表達，結果發現，5-HT和5-HT 2B受體激動劑均可使AKT的磷酸化增加，這種作用也能被5-HT 2B受體拮抗劑所拮抗，提示5-HT的抗肝細胞凋亡作用很可能是通過5-HT 2B受體介導的，激活PI3K/AKT信號通路，從而使肝細胞凋亡減少，為臨床應用5-HT制劑抑制肝細胞凋亡，保護肝細胞損傷提供新的依據。

本研究主要局限在于肝細胞系尤其是人肝癌細胞系HepG2細胞上的研究，缺乏在體實驗的有力支持，尚需要動物實驗進一步驗證。