非酒精性脂肪性肝病患者血清TLR4、IL-10、IL-22與腸道菌群的相關性

張丹琴 楊帆 李勝保

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種慢性肝臟疾病，主要病理特征是彌漫性肝細胞大泡性脂肪病變[1]。NAFLD患者存在腸道菌群失調，直接影響脂肪的儲存和代謝。Toll樣受體4(TLR4)是Toll樣受體(TLR)家族成員之一，其可通過相關信號通路介導炎性反應[2]。白介素-22(IL-22)是白介素-10(IL-10)家族成員，均是促炎癥因子，參與炎性反應和組織修復[3]。為了探討NAFLD患者腸道菌群變化與TLR4、IL-10、IL-22的相關性，本文選取我院收治的126例NAFLD患者進行研究?，F將結果報道如下。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年6月至2018年8月期間我院收治的126例NAFLD患者進行研究。所有患者均確診為NAFLD。納入標準：均符合2010年NAFLD診療指南[4]；排除標準：自身免疫性肝病和病毒性肝炎等引起的脂肪肝；合并嚴重腦、心、腎等功能障礙；惡性腫瘤；血液系統疾?。幻庖呦到y疾??；近期應用過抗生素、酸奶、微生態調節劑等影響腸道菌群的制劑。

二、一般資料

126例患者中男性68例，女性58例，年齡23～65歲，平均(48.35±6.24)歲，其中單純性非酒精性脂肪肝(NAFL)49例，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)54例，肝硬化23例。對照組為同期進行體檢的健康人90例，男性47例，女性43例，年齡24～64歲，平均(48.02±6.09)歲。兩組一般資料具有可比性(P>0.05)。

三、方法

(一)腸道菌群及腸道定植抗力 采集兩組研究對象的新鮮糞便1.5 g，放置于密閉無菌盒中，0.5 h內送檢。稱取0.5 g樣本放入有4.5 mL無菌生理鹽水中混合均勻，按照10倍連續稀釋法分別稀釋至10～9，分別取10～9、10～7、10～5、10～3、10～1稀釋液50 μL依次接種在選擇性培養基上。雙歧桿菌用BS血瓊脂平板，乳酸桿菌用MRSA營養瓊脂平板，腸桿菌用中國蘭瓊脂平板，腸球菌用羊血平板。需氧菌雙歧桿菌、乳酸桿菌放置于35℃孵箱中培養24 h，厭氧菌腸桿菌、腸球菌采用抽氣換氣培養法培養48 h。采用法國生物梅里埃公司ATB半自動微生物鑒定系統進行細菌鑒定。B/E值為雙歧桿菌和腸桿菌數量的比值，代表腸道定植抗力。

(二)血清TLR4、IL-10、IL-22檢測 抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血4 mL，采用酶聯免疫吸附法檢測IL-10、IL-17和IL-23。

四、統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析。血清TLR4、IL-10、IL-22水平為計量資料，兩組間均數比較采用t檢驗。采用Pearson相關性分析和logistic多元回歸分析進行影響因素分析。檢驗水準α=0.05，當P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、兩組腸道菌群含量的比較

與對照組比較，NAFLD組雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值更低(P<0.05)，腸桿菌、腸球菌更高(P<0.05)。見表1。

二、兩組血清TLR4、IL-10、IL-22水平的比較

NAFLD組血清TLR4顯著高于對照組，IL-10、IL-22低于對照組(P<0.05)。見表2。

三、NAFLD患者TLR4、IL-10、IL-22與腸道菌群的相關性分析

經過Pearson相關性分析，NAFLD患者TLR4與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈負相關(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正相關(P<0.05)；IL-10、IL-22與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈正相關(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正負相關(P<0.05)。見表3。

四、 NAFLD患者腸道菌群的logistic回歸分析

以B/E值為自變量，TLR4、IL-10、IL-22為因變量，進行logistic回歸分析發現，TLR4、IL-10、IL-22是NAFLD患者B/E值的影響因素。結果見表4。

表1 兩組腸道菌群含量比較(lg CFU/g, ±s)

表2 兩組血清TLR4、IL-10、IL-22水平比較(±s)

表3 NAFLD患者TLR4、IL-10、IL-22與腸道菌群的相關性分析

表4 NAFLD患者腸道菌群的logistic回歸分析

討 論

有許多研究表明[5]，NAFLD的發生與腸源性內毒素血癥有密切關系，而細菌移位、小腸細菌過度生長、腸黏膜通透性異常等均可引起腸源性內毒素血癥。在正常人的腸道內，各種菌群保持著動態平衡，維護著腸黏膜屏障和免疫屏障[6]。當腸道菌群失調時，會導致有害菌異常增加，使腸道黏膜屏障受損，大量內毒素進入門靜脈，損害肝細胞，同時通過肝臟進入血液形成內源性內毒素血癥，引發炎癥反應，形成惡性循環[7]。

TLR是一類天然免疫關鍵受體。作為TLR家族一員，TLR4是革蘭氏陰性細菌細胞壁成分LPS的受體，具有誘導炎癥、抗病毒、抑制細胞因子產生等作用。TLR4表達于各種肝細胞，當TLR4過度表達時，可誘導肝臟發生免疫應答，引起肝臟慢性炎癥反應性疾病[8]。

IL-10是一種重要的免疫調節細胞因子，由Th2細胞和單核-巨噬細胞產生，其可通過抑制單核細胞、巨噬細胞活性，抑制肝纖維化進程[9]。

本研究結果表明，與對照組相比，NAFLD組雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值更低(P<0.05)，腸桿菌、腸球菌更高(P<0.05)。證實NAFLD患者確實存在腸道菌群失調。腸道定植能力是指內源性厭氧菌抑制潛在致病菌在腸道內定植的能力，因此B/E值可以全面評價腸道的菌群變化。本研究還表明，與對照組相比，NAFLD組血清TLR4更高，IL-10、IL-22更低(P<0.05)。說明NAFLD患者體內血清TLR4、IL-10、IL-22水平異常變化。研究表明[10]，NAFLD患者由于腸道菌群失調，肝臟中內毒素(LPS)增多，使得LPS受體TLR4表達上調，腸壁通透性增強，形成腸源性內毒素血癥，引發炎癥反應，同時還通過MyD88途徑激活核因子B，引發強力的炎癥反應，最終導致肝臟損傷。研究表明，隨著肝損傷程度的加重，IL-10表達逐漸降低，從而參與酒精性肝病發展過程[11]。IL-22是IL-10的同源性細胞因子，可能具有相同的保護肝臟的作用。相關研究表明[12]，經過IL-22處理的ApoE基因敲除小鼠，血脂及肝指數均降低，能減輕小鼠肝臟的炎癥程度，提示IL-22能緩解肝臟病變進程，抑制肝纖維化。

經過Pearson相關性分析，NAFLD患者TLR4與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈負相關(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正相關(P<0.05)；IL-10、IL-22與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈正相關(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正負相關(P<0.05)。經logistic回歸分析發現，IL-10、IL-17、IL-23是NAFLD患者B/E值的影響因素。分析其可能原因是NAFLD患者腸道菌群紊亂，產生大量內毒素，誘導TLR4過表達，當TLR4過度表達時，可導致腸壁通透性增強，形成腸源性內毒素血癥，進而誘導肝臟發生免疫應答，引起肝臟慢性炎性病變；另外，TLR4還可能通過MyD88途徑激活NFκB，進而刺激炎性因子的釋放，抑制IL-10、IL-22的分泌，放大肝臟炎癥反應，由此共同參與NAFLD過程。因此推測，TLR4與IL-10、IL-22可能存在上下游關系，可能是NAFLD發展過程中的一個炎癥通路，但還需進一步的研究驗證。