杜仲誘導骨髓間充質干細胞成骨分化防治骨質疏松癥相關信號通路研究進展

趙繼榮 楊濤 趙寧 馬同 薛旭 李瑋農 張立存

1.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050 2.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730030

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種因骨密度降低和骨組織微結構破壞導致的骨骼強度減低而易發生骨折的慢性骨代謝性疾病[1]。現已成為全球主要的公共衛生問題，具有較高的發病率和嚴重的死亡率。據統計，全世界約2億婦女受其影響，由骨質疏松引發的骨折每年可高達890萬次以上。而在中國，骨質疏松癥影響著近700萬50歲以上的中國人，并且每年會造成近69萬例髖部骨折[2]。因而對于OP的發病機制及診療方法的探究一直是一個研究熱點。現代醫學對OP研究已經深入到分子學水平，認為由破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成的偶聯平衡被打破致使骨吸收大于骨形成是引發骨質疏松的主要發病機制[3]。故上調骨形成或抑制骨吸收是治療OP的重要原則。中醫將OP稱之為“骨萎”，根據經典理論“腎主骨生髓”常治療以“補腎益髓”之法。多年來，研究人員在此理論指導下結合骨組織工程及細胞培養等高新技術，在OP的基礎研究及臨床治療方面成果顯著。本文作者查閱大量國內外相關文獻，茲就傳統中藥杜仲誘導骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨細胞分化從而防治OP的相關信號通路研究作以綜述，以期為該病臨床診療提供新思路,從而造福廣大OP患者。

1 杜仲-骨質疏松癥相關研究

杜仲為杜仲科植物杜仲(eucommia u1moides oliv.)的干燥樹皮，性甘溫，歸肝、腎經，具有補肝腎，強筋骨，安胎之效[4]。作為我國傳統中藥，在臨床實踐中已使用兩千多年，神農本草經列為上品，曰其“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨”[5]。現代研究[6]顯示杜仲皮、葉、花、種子不同部位含有木脂素類、環烯醚萜類、黃酮類、萜類、甾體類、酚酸及多糖類等大約205種化學成分，并且現代藥理學研究發現其具有預防骨質疏松、降血糖、控血壓、調血脂、保肝、抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性。而近年來研究最多的則是其用于治療骨質疏松癥。大量研究表明杜仲的水、醇提取物或者含藥血清能夠促進成骨細胞增殖，激活骨重建，改善骨代謝，防治OP。堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、骨保護素(OPG)及Ⅰ型前膠原C-端前肽/N-端前肽(PICP/PINP)均為骨形成標志物，能夠反映成骨細胞的活性[7]。方寧等[8]采用不同濃度梯度的杜仲葉提取物對大鼠成骨細胞進行干預，發現杜仲葉提取物可以通過促進骨鈣素(BGP)的表達而影響成骨細胞的增殖，且呈現濃度依賴性。翁澤斌等[9]使用杜仲及其鹽制品對去卵巢雌性大鼠進行干預，發現杜仲生品及鹽制品在抑制血鈣降低的同時能夠升高血磷、ALP和BGP，從而降低高骨轉換率，發揮治療OP的作用，且鹽制杜仲效果更優。另外曹旭等[10]采用杜仲不同濃度的含藥血清對小鼠MC3T3-E1 Subclone 14成骨細胞進行干預，發現杜仲含藥血清能夠促進成骨細胞增殖，增加ALP的分泌，上調OPG/RANKL系統以改善骨重建和骨平衡。胡倩影等[11]研究發現杜仲有效成分松脂素二葡萄糖苷能夠促進OPG的分泌來抗骨質疏松，松脂素則既能通過促進OPG分泌又能通過抑制RANKL表達來發揮作用。除了上述及大量研究證實了杜仲可作用于成骨細胞，促進成骨細胞增殖，增加其活性，發揮抗骨質疏松作用外，還有研究表明杜仲能夠誘導BMSCs增殖及向成骨細胞定向分化，從而發揮抗骨質疏松作用，但是其具體分子機制及信號轉導通路尚不清楚，存在爭議。

2 杜仲-BMSCs成骨分化-骨質疏松癥相關信號通路研究

骨質疏松癥發病機制主要是因為成骨細胞與破骨細胞平衡被打破，骨吸收大于骨形成，因而成骨細胞在抗骨質疏松中起至關重要的作用。研究發現成骨細胞主要來源于BMSCs。20世紀70年代Friedenstein等[12]首次從大鼠骨髓中分離出BMSCs，并發現此細胞可以向骨細胞分化，此后Crapnell等[13]研究發現BMSCs可以很容易地在體外環境進行擴增，Bianco等[14]在體內實驗中發現BMSCs具有較強的自我更新能力。后來研究[15]發現BMSCs具有多項分化的潛能，在一定誘導條件下，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、心肌細胞等。因為具有較強的自我更新能力，能夠在離體條件下擴增且具有多項分化的潛能，BMSCs成為了細胞治療和組織工程中有用的工具。

近年來，使用中藥制劑誘導BMSCs 向成骨細胞分化來防治OP受到廣泛的關注，成為臨床研究和實驗研究的熱點之一。誘導BMSCs分化為成骨細胞是一個高度復雜且程序化的過程，在多種信號分子的共同作用下，BMSCs首先產生骨前體細胞，隨后依次形成骨原細胞、前成骨細胞、功能性骨形成細胞，最后形成成熟骨細胞[16]。臨床多使用地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C組合作為成骨誘導劑。而近年來研究發現傳統補腎中藥杜仲提取物或其含藥血清可以作為BMSCs成骨分化的誘導劑，而其發揮作用的機制涉及Wnt/β-catenin、MAPK、RhoA/ROCK等多種信號通路，下面對其進行闡述。

2.1 杜仲對Wnt/β-catenin 信號通路調控研究

Wnt信號通路為目前骨代謝相關疾病發病機制的研究熱點。Wnt參與的信號通路包括經典的Wnt/β-catenin途徑以及非經典的 Wnt/PCP與 Wnt/Ca2+途徑[17]。其中經典Wnt/β-catenin信號通路是調節骨骼發育和維持骨骼內穩態的重要信號調節通路[18]。該信號通路由Wnts蛋白、低密度脂蛋白相關受體蛋白5/6(LPR5/6)、卷體蛋白(frizzled,Frz)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、散亂蛋白 (dishevelled, Dsh)、β-鏈蛋白 (β-catenin)、結直腸腺瘤性息肉蛋白 (APC)、軸蛋白(Axin)和核內轉錄因子T細胞因子(TCF)/淋巴樣增強因子(LEF)等幾種蛋白質構成[19]。Wnt/β-catenin信號通路主要通過調控成骨細胞定向分化和特異性基因的表達，增強成骨細胞的活性，促進細胞外基質的礦化，促進骨形成，調控骨重建。

研究發現杜仲可以誘導BMSCs向成骨細胞分化來治療OP。張賢等[20]用杜仲醇提取物對第3代SD大鼠BMSCs進行干預，采用熒光定量PCR法檢測杜仲誘導BMSCs向成骨細胞分化過程中Wnt信號通路中多種相關因子的表達變化，發現與陰性對照組比較，誘導3 d后Fzd2表達升高11.86倍，Fzd3升高達到2倍；誘導7 d后，Fzd2表達升高5.12倍，Fzd3恢復到正常水平；β-catenin 在誘導3 d 時表達升高達2倍；WIF1在誘導3 d和7 d后表達顯著下降，說明杜仲誘導BMSCs成骨分化主要與上調Wnt/β-catenin 信號通路中的Fzd2、Fzd3、β-catenin蛋白受體，下調Wnt蛋白抑制因子WIF1因子相關。湯軍等[21]采用杜仲醇提取物對大鼠BMSCs進行誘導，發現Fzd受體參與了杜仲誘導BMSCs成骨分化的過程，響應時間出現在第3天。綜上所述，杜仲誘導BMSCs成骨分化主要是通過對Wnt/β-catenin 信號通路的調控，主要與Fzd2及Fzd3受體、β-catenin蛋白、WIF1因子有關。

2.2 杜仲對MAPK信號通路調控研究

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于一系列哺乳動物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞外刺激到細胞核的重要傳遞者，是參與細胞分化、細胞增殖、細胞死亡和細胞運動等多方面的重要信號轉導酶[22]。其家族包括細胞外信號調節激酶(extracellular-signal regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38MAPK三種蛋白激酶[23]。ERK是最早被發現的MAPK信號通路，包括ERK1及ERK2兩種亞型，兩種均在成骨細胞中表達，p38MAPK具有p38α、p38β、p38γ和p38δ四種亞型，JNK信號通路共有JNK1、JNK2、JNK3三種亞型，其中JNK1和JNK2普遍表達，而JNK3的表達較局限，主要存在于神經元中[24]。MAPK信號轉導主要是通過三級酶促級聯反應進行，首先MAP3K磷酸化MAP2K，被磷酸化激活的MAP2K中存在針對下游MAPK128的MAPK對接結構域，確保了MAP2K磷酸化激活MAPK的特異性，被活化的MAPK磷酸化激活下游多種靶基因的表達[25]。近年來，多項研究表明MAPK信號通路在促進BMSCs成骨分化改善OP的過程中發揮了至關重要的作用。Yang等[23]研究發現葛根中的主要異黃酮類化合物葛根素能夠使ERK1/2和p38磷酸化，從而誘導BMSCs成骨分化。Song等[26]研究發現淫羊藿主要活性黃酮苷即淫羊藿苷可迅速誘導ERK和JNK活化，從而使成骨細胞增殖。

研究發現補腎中藥杜仲誘導BMSCs成骨分化與MAPK信號通路密切相關。張立超等[27]研究發現杜仲葉提取物可以激活MAPK/ERK磷酸化活性來促進大鼠成骨細胞增殖。陳林攀等[28]用杜仲葉提取物槲皮素對SD 大鼠第三代BMSCs進行干預，Western blot結果顯示槲皮素能夠提高ERK的磷酸化水平，在促進成骨細胞增殖的同時，激活Shp2，活化ERK信號通路從而促進大鼠 BMSCs 增殖和成骨分化。

2.3 杜仲對RhoA/ROCK信號通路研究

在BMSCs成骨分化的進程中，細胞骨架會發生改變，而Ras同源基因/Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶(RhoA/ROCK)信號通路是調控細胞骨架的關鍵信號通路之一。Rho蛋白包括Rho A、Rho B、Rho C、Rho D、Rho E五種亞型，屬于小G蛋白家族，其中Rho(A-C)具有高度同源性。當Rho與鳥嘌呤二核苷酸磷酸(GDP)結合時處于失活狀態，與鳥嘌呤三核苷酸磷酸結合時被激活，ROCK是Rho的主要下游靶基質，包括ROCK1和ROCK2兩種亞型，多項研究表明RhoA/ROCK信號通路在BMSCs成骨分化過程中發揮著重要作用。Zhang等[29]研究發現二甲氧甘氨酸通過激活RhoA/ROCK信號通路能夠促進BMSCs成骨分化。Yang等[30]研究表明RhoA/ROCK信號通路可能通過介導細胞骨架變形來促進BMSCs的成骨分化。Saidova 等[31]認為RhoA/ROCK信號通路無論是通過增加張力還是通過從動態微管中釋放出的FGF-H1的激活都有利于成骨，并抑制BMSCs向軟骨細胞及脂肪細胞分化。

研究發現中藥杜仲可通過RhoA/ROCK信號通路誘導BMSCs的成骨分化。林奇生等[32]用杜仲醇提取物對OP大鼠模型進行灌胃干預，發現杜仲中高劑量組大鼠ROCK1、RhoA mRNA表達量、BMSCs成骨誘導后骨橋蛋白 (OPN)、Runt相關轉錄因子2 (Runx2)、骨鈣素 (OCN) mRNA表達顯著升高，這表明杜仲醇提取物能夠促進BMSCs增殖及成骨分化。

3 總結與展望

OP作為全世界面臨的重大公共衛生健康問題，現代分子生物學研究認為由成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收形成的偶聯平衡被打破致使骨吸收大于骨形成是其主要發病機制，故而促使成骨細胞增殖可有效防治OP。而BMSCs作為一種多潛能干細胞，是成骨細胞的前體細胞，在一定誘導條件下可向成骨細胞定向分化。中國醫藥學是一個偉大的寶庫，中醫學稱OP為“骨萎、骨枯、骨極”，在中醫經典理論“腎主骨生髓”指導下，常用以補腎中藥來治療OP。近年來，研究人員將此理論與骨組織工程及細胞培養等高新技術相結合，發現傳統補腎中藥杜仲能夠有效防止OP，其機制可能與誘導BMSCs增殖及向成骨細胞定向分化，重新建立骨吸收與骨形成的偶聯平衡相關。而其誘導BMSCs成骨分化機制涉及Wnt/β-catenin、MAPK及RhoA/ROCK等多種復雜的信號通路。目前研究發現杜仲能夠上調Wnt/β-catenin 信號通路中的Fzd2、Fzd3、β-catenin蛋白受體，下調Wnt蛋白抑制因子WIF1因子，能夠激活Shp2，活化ERK信號通路，并且能夠影響RhoA/ROCK信號通路中ROCK1、RhoA mRNA表達量、BMSCs成骨誘導后骨橋蛋白 (OPN)、Runt相關轉錄因子2 (Runx2)、骨鈣素 (OCN) mRNA表達，從而誘導BMSCs向成骨細胞定向分化，發揮防治OP的作用。

許多傳統的中草藥已經在臨床實踐中使用了數千年，它們被證明有效，適應癥廣泛，安全性高，但是其復雜的化學成分導致其物質基礎及作用機制不明確，這成為制約中藥走向世界的瓶頸問題。杜仲皮、葉、花、種子不同部位含有大約205種化學成分，其防治OP物質基礎及作用機制有待進一步探索，這就需要結合現代科技手段，融合生物、化學、信息等多學科，發現其在治療OP中的新靶點、新物質及新機制，讓其走向世界，造福于人類。