微波輔助合成法制備萬古霉素開管毛細管電色譜柱

摘 要 采用微波輔助合成技術，快速制備了萬古霉素開管毛細管電色譜柱。以D，L-色氨酸為目標物質，優化了萬古霉素鍵合時的微波條件。結果表明: 在微波時間45 min，微波功率300 W，微波溫度60 ℃的條件下制得的電色譜柱分離效果最佳。利用在最佳條件下制備的電色譜柱成功分離了4種手性對映體。在pH 4.0～70的范圍內考察了空管、硅烷化柱和萬古霉素柱的電滲情況，結果表明，萬古霉素開管毛細管電色譜柱有效地降低了電滲，且對電滲降低起主要作用的是硅烷化試劑。以D，L-色氨酸考察了電色譜柱的穩定性和重現性，結果顯示，采用微波輔助合成技術制得的萬古霉素開管毛細管電色譜柱具有良好的穩定性和重現性。

關鍵詞 開管毛細管電色譜；萬古霉素；微波輔助合成

1 引 言

開管毛細管電色譜（Open tubular capillary electrochromatography， OT-CEC）是毛細管電色譜的重要分支。OT-CEC主要通過涂布、鍵合和溶膠-凝膠等方法在柱內壁制備薄層固定相，避免了塞子效應、焦耳熱及產生氣泡等一系列問題，且制備過程簡單，柱效高[1～3]。微波輔助合成技術是近年來發展的新型合成技術。它不同于傳統加熱，具有內外同熱、加熱速度快、選擇性好等特點，不僅能有效提高反應速率和轉化率，而且體現出節能、環保等優點，其作為提高生產效率、綠色化工的手段之一而備受關注[4，5]。萬古霉素（VA）最早被Armstrong等[6，7]用于制備液相色譜手性固定相，其分離機理綜合了蛋白質、環糊精等手性固定相所具有的特點，已成為極具發展潛力的一類新型手性固定相。Dong等[8]以高碘酸鈉氧化鄰位二醇為醛基鍵合萬古霉素的方法，制備了萬古霉素整體住，對多種β-阻斷劑類藥物的拆分顯示了良好的分離性能。張大同等[9]采用“一鍋法”，以1，6-二異氫酸正己酯作間隔臂，制備了苯異氰酸酯衍生化的萬古霉素手性固定相。 Staroverov等[10]采用環氧硅膠與萬古霉素直接鍵合的方法，制備了萬古霉素填充柱，成功分離了多種氨基酸對映體。但以微波技術快速制備萬古霉素毛細管電色譜柱的方法尚未見報道。

本課題組曾利用微波輔助合成法制備了聚酰胺-胺樹枝狀分子修飾的開管毛細管電色譜柱[11]，對丙氨酸和脯氨酸進行分離，取得了良好的分離效果。本研究在前期工作的基礎上，將微波輔助合成技術應用到以萬古霉素為手性固定相的開管毛細管電色譜柱的制備中，優化了制柱的微波條件，考察了柱子的分離性能、重現性和穩定性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

石英毛細管（350 SymbolmA@ m o.d.×75 SymbolmA@ m i.d.，河北永年光導纖維廠）；MDQ毛細管電泳儀（美國Beckman Coulter公司）；MSP-100E微波萃取儀（北京瑞利分析儀器公司）。

萬古霉素鹽酸鹽（意大利Inalco S.P.A.公司）；γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH560，北京申達精細化工有限公司）；D，L-色氨酸、D，L-苯丙氨酸、D，L-酪氨酸（純度＞98%，北京化學試劑公司）；D，L-2-苯乙醇、1-苯基-1，2-乙二醇（德國Acros公司）；NaOH、HCl、甲苯、無水甲醇、丙酮、冰醋酸、三乙胺等均為分析純（北化精細化學品有限責任公司）；實驗用水為去離子水，樣品及緩沖液均用0.45 SymbolmA@ m纖維素脂膜過濾。

2.2 微波輔助合成法制備萬古霉素開管毛細管電色譜柱

截取一定長度的毛細管，先用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗1 h，去離子水沖洗5 min后，用0.1 mol/L HCl溶液沖洗15 min，再用去離子水、無水甲醇、氮氣、甲苯各沖洗5 min。然后在0.2 MPa壓力下，通入10%（V/V）γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液1 h，封口后置于微波萃取儀中，在300 W的功率、40 ℃下反應10 min，制得硅烷化柱，用甲苯、無水甲醇、去離子水各沖洗5 min。通入5 g/L萬古霉素-Na2HPO4溶液（pH 8.0）1 h，封口后置于微波萃取儀中，進行合成反應。制備好的毛細管柱用去離子水沖洗備用。萬古霉素開管毛細管電色譜柱制備流程如下所示。

3 結果與討論

3.1 萬古霉素鍵合時微波條件的優化

本研究選取D，L-色氨酸為被分離物質，以三乙胺醋酸鹽（TEAA）為緩沖溶液，應用不同條件制備的萬古霉素開管毛細管電色譜柱對D，L-色氨酸進行分離，通過比較分離度來優化萬古霉素鍵合時的微波條件。

3.1.1 微波時間的影響 在微波功率300 W，微波溫度60 ℃的條件下，選擇制柱的微波時間分別為30，40，45，50和60 min。應用上述條件制備好的電色譜柱，在pH 6.0，分離電壓20 kV，TEEA緩沖液濃度為1%的條件下分離D，L-色氨酸。從圖1可知，在微波時間為45 min的條件下，制備的萬古霉素開管毛細管電色譜柱對D，L-色氨酸的分離度最大，達到1.98。D，L-色氨酸的分離效果如圖2所示。因此微波合成時間選取45 min。

分 析 化 學第39卷

第1期勾新磊等: 微波輔助合成法制備萬古霉素開管毛細管電色譜柱

圖1 微波時間對D，L-色氨酸分離度的影響

Fig．1 Effects of microwave time on resolution of D，L-tryptophan

毛細管（Capillary）：50.2 cm×75 SymbolmA@ m i. d.，有效長度（Effective length）40 cm；進樣壓力（Sample injections）： 3.45 kPa for 5 s；分離電壓（Separation pressure）： 20 kV；緩沖溶液（Buffer）：pH 6.0，1%（V/V）TEAA；檢測波長（Wavelength）：254 nm；溫度（Temperature）：25 ℃；樣品（Sample）： D，L -色氨酸（D，L-Tryptophan，01 g/L）。

圖2 萬古霉素開管毛細管電色譜柱對D，L-色氨酸的分離

Fig．2 Chiral separation of D，L-tryptophan by vancomycin（VA） modified OT-CEC

條件同圖1（Conditions are the same as in Fig．1）。

3.1.2 微波功率的影響 在微波時間45 min，微波溫度60 ℃的條件下，選擇制柱的微波功率分別為225，300，375，450和525 W。在上述條件下制備電色譜柱并用于分離D，L-色氨酸。從圖3a可知，在微波功率為300 W時，制備的萬古霉素開管毛細管電色譜柱對D，L -色氨酸分離度達到最大。因此微波合成的功率選取300 W。

3.1.3 微波溫度的影響 在微波時間45 min，微波功率300 W的條件下，選擇制柱的微波溫度分別為40，50，60，65，70和80 ℃。在上述條件下制備電色譜柱并用于分離D，L-色氨酸。從圖3b可知，在微波溫度為60 ℃時，制備的萬古霉素開管毛細管電色譜柱對D，L -色氨酸分離度達到最大。因此微波合成的溫度選取60 ℃。

圖3 微波功率（a）和微波溫度（b）對D，L-色氨酸分離度的影響

Fig．3 Effects of microwave power （a） and microwave temperature （b） on resolution of D，L-tryptophan

條件同圖1（Conditions are the same as in Fig．1）。

3.2 電滲流的測定

本實驗考察了空管、硅烷化柱和萬古霉素柱的電滲流隨pH值變化情況。從圖4可見，各個毛細管柱的電滲流均隨pH值的增加而增大；圖4 不同柱子電滲流隨pH值變化圖

Fig．4 Electroosmotic flow （EOF） of different capillaries at different pH

A. 空管（Bare capillary）；B. 硅烷化柱（KH560 modified capillary）；C. 萬古霉素（Vancomycin immobilized capillary）；樣品（Sample）： 3％ acetone。其它條件同圖1（Other conditions are the same as in Fig．1）。

空管的電滲流最大，而萬古霉素柱與硅烷化柱的電滲流基本相同。這主要是因為空毛細管內壁存在大量SiOH，在pH 4.0～7.0的范圍內，毛細管內表面帶負電。用KH560修飾的毛細管柱其內表面存在環氧基團，在上述的pH值范圍內，環氧基團被質子化，因此KH560修飾的毛細管柱與空管相比，所帶的負電荷減少，相應表現的電滲流值也比空管低。又因為萬古霉素本身既含有酸性基團，又含有堿性基團，隨著pH值的增大，兩者的電離始終趨于平衡，對電滲的影響不明顯。因此對電滲降低起主要作用的是KH560，而手性選擇劑的貢獻很小，這與文獻[12]的結果一致。

3.3 手性對映體的分離

為了考察在最佳微波條件制備的萬古霉素開管毛細管電色譜柱的分離性能，選取了D，L-酪氨酸、D，L-苯丙氨酸、D，L-2-苯乙醇及1-苯基-1，2-乙二醇進行分離。如圖5所示，在pH 5.0，分離電壓20 kV，TEEA緩沖液濃度為1%的條件下，D，L-酪氨酸、D，L-苯丙氨酸、D，L-2-苯乙醇及1-苯基-1，2-乙二醇的分離度分別為2.19，1.83，2.23和1.88，均達到基線分離。圖5 萬古霉素開管毛細管電色譜柱對多種手性對映體的分離

Fig．5 Separation of four enantiomers by VA modified OT-CEC

a. D，L-酪氨酸（D，L-Tyrosine）；b. D，L-苯丙氨酸（D，L-Phenylalanine）；c. D，L-2-苯乙醇（D，L-2-phenylethanol）；d. 1-苯基-1，2-乙二醇（1-Phenyl-1，2-ethanediol）；緩沖溶液（Buffer）：pH 5.0，1%（V/V） TEAA。 其他條件同圖1（Other conditions are the same as in Fig．1）。

3.4 萬古霉素開管毛細管電色譜柱的穩定性和重現性

本實驗以D，L-色氨酸為目標物質，檢測了萬古霉素開管毛細管電色譜柱的穩定性與重現性。D，L-色氨酸連續進樣6次，第一個峰的遷移時間（tR，1）、理論塔板數（N1）及分離度（RS）的RSD值見表1。實驗證明，微波輔助合成法制備的萬古霉素開管毛細管電色譜柱具有良好的重現性。

連續檢測10 d（每天5次），D，L-色氨酸第一個峰的遷移時間、理論塔板數以及分離度的RSD值分別為3.53%， 6.23%和6.84%。結果顯示，采用微波輔助合成技術制得的萬古霉素開管毛細管電色譜柱具有良好的穩定性。

表1 遷移時間、理論塔板數以及分離度的重現性（n＝6）

Table 1 Reproducibility of migration time， column efficiency and resolution（n＝6）

12

3456RSD（%）

遷移時間

Migration time （tR，1 ， min）18.2318.0218.4118.3518.2118.240.82理論塔板數

Theoretical plate number

（105， N1/m）1.291.271.311.321.281.29

1.26

分離度

Resolution （RS）1.981.961.971.961.921.961.31

條件同圖1（Conditions are the same as in Fig．1）。

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Preparation of Open Tubular Capillary Electrochromatography

Column with Immobilized Vancomycin as Chiral

Stationary Phase by Microwave Irradiation

GOU Xin-Lei， E Hong-Jun， SU Ping， YANG Yi*

（College of Science， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 100029）

Abstract Microwave irradiation was introduced into the preparation of open tubular capillary electrochromatographic（OT-CEC） column with immobilized vancomycin as chiral stationary phase. To evaluate the electrochromatographic performance by different microwave time， microwave power and microwave temperature， the enantiomeric separation of D，L-tryptophan was investigated. The results verified under the optimized conditions， while microwave time was 45 min， microwave power was 300 W， and microwave temperature was 60 ℃， enantioselectivity was obtained for the chiral amino acid. The change of electroosmotic flow（EOF） was measured by varying the pH values of the mobile phase. The results indicated that vancomycin immobilized capillary decreased EOF effectively and the predominant source of the decrease is resulted from the silica base material. Baseline separation of four enantiomers could be achieved by the column， respectively. The reproducibilities were also evaluated by D，L-tryptophan.

Keywords Open tubular capillary electrochromatography; Vancomycin; Microwave irradiation

（Received 2 March 2010; accepted 9 May 2010）