膠質母細胞瘤免疫治療研究現狀與展望

鄭蘭 林貞花 楊洋

(延邊大學醫學院病理學教研室 吉林省科技廳重點實驗室，吉林 延吉 133002)

神經膠質瘤在成人中是一種最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，其中膠質母細胞瘤(GBM)發病率占50%以上〔1〕，是最具侵襲性的亞型，患者中位生存期約18個月〔2〕。目前GBM的標準治療方案包括手術治療、結合放療和化療〔3〕。然而，由于GBM腫瘤細胞的浸潤性生長及受腫瘤部位制約，手術難以完整切除腫瘤。此外放化療無法特異性識別腫瘤細胞，且易耐藥，患者臨床獲益甚微。近來有研究發現大腦通過腦膜淋巴管與外周免疫系統相連〔4〕，這一重要發現使得腫瘤免疫治療有望成為GBM最具前景的治療策略，為其治療提供了新的方向。本文就目前GBM 免疫治療的策略及與臨床試驗結果相關的生物學標記物的研究進展做一綜述。

1 免疫檢查點抑制劑

T細胞表面的抑制性受體，即免疫檢查點，可降低T細胞對腫瘤細胞的免疫應答。免疫檢查點抑制劑可通過提高免疫檢查點調解T細胞活性，從而誘導持續的抗腫瘤免疫應答。免疫檢查點抑制劑的應用為晚期癌癥的治療帶來了近乎革命性的改變。免疫檢查點抑制劑包括程序性細胞死亡蛋白(PD)-1，其配體PD-L1和4型細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白(CTLA-4)抑制劑，能夠改變人體免疫系統，從正常的適應性免疫系統轉變為增強的免疫活化系統。在臨床前研究中檢查點抑制劑顯示出治療GBM的前景。目前美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的免疫檢查點抑制劑包括ipilimumab(CTLA-4 抑制劑)，pembrolizumab和nivolumab(PD-1抑制劑)及durvalumab，atezolizumab和avelumab(PD-L1抑制劑)。PD-1抑制劑聯合CTLA-4抑制劑〔5〕和放射治療〔6〕能顯著延長GBM模型小鼠生存期。Checkmate143觀察nivolumab對復發性GBM患者中位總生存時間(OS)無改善作用。Filley等〔7〕分析該結果可能與GBM腫瘤微環境的免疫抑制，系統免疫抑制及抗體無法通過血腦屏障有關；在復發性GBM中免疫檢查點抑制劑在重新激活免疫細胞方面效果較差；此外該研究在終止免疫治療前沒有通過病理檢查證實腫瘤復發，因很難區分炎癥治療反應和腫瘤進展，可能導致過早終止試驗。目前關于抗LAG3檢查點抑制劑聯合PD-1和CD137抑制劑治療復發性GBM的臨床試驗正在進行，結果尚未公布(NCT02658981)。

2 腫瘤疫苗

一般來說，疫苗將免疫系統暴露在一個被削弱或被殺死的抗原下，以建立免疫記憶，以抵御未來任何對該抗原的暴露。腫瘤疫苗作用機制與此類似，可利用腫瘤相關抗原激活特異性T細胞并誘導炎癥反應，增強機體抗腫瘤能力，達到抑制腫瘤目的。

2.1樹突細胞(DCs)疫苗 DCs是骨髓來源淋巴細胞CD4+和CD8+T細胞的抗原提呈細胞(APC)，在主要組織相容性復合體(MHC)環境下也是自然殺傷(NK)細胞和NK-T細胞的激動劑。在GBM微環境中MHC表達下調，抗原提呈效率下降〔8〕，使得有效的抗原提呈對大腦成功的免疫治療至關重要。在小鼠中研究發現外周注射DC疫苗能誘導細胞毒性T淋巴細胞在中樞神經系統(CNS)的應答而不產生自身免疫應答；DC疫苗有靶向抑瘤作用，對正常腦組織無損傷〔9〕。CD133+細胞是潛在的腦腫瘤啟動細胞，也是GBM腫瘤干細胞常用標記物〔10〕，與GBM對放、化療抵抗及放療后腫瘤復發密切相關。Ⅰ期臨床試驗結果發現載有ICT-121的DCs(CD133致敏)能顯著延長表達人類白細胞抗原(HLA)-A2的復發性GBM患者的生存期(NCT02049489)。在Ⅲ期臨床試驗中Liau等〔11〕采用自體腫瘤裂解液構建的DCVax-L疫苗治療已接受標準放療聯合莫替唑胺(TMZ)化療的GBM患者，其OS達到了23.1個月。大量的臨床試驗(NCT01808820、NCT02649582、NCT02529072、NCT01567202、NCT0-1567202、NCT01204684、NCT00639639、NCT02465268)仍在進行中。

2.2多肽疫苗 多肽疫苗中被廣泛研究的靶點是表皮生長因子受體(EGFR)。在GBM中EGFR高表達，常發生突變，其中EGFRRvⅢ截短突變體最為常見。與野生型EGFR比較，EGFRRvⅢ沒有配體結合域，因此呈持續激活狀態，促進GBM發生，因此EGFRRvⅢ可作為免疫治療的腫瘤特異性靶點。Ⅱ期臨床試驗發現接受EGFRvⅢ靶向肽類疫苗-Rindopepimut(CDX-110)治療GBM初診患者無進展生存期(PFS)和OS分別延長至14.2個月和26個月，無明顯不良反應〔12〕。細胞替代療法(ACT)-Ⅱ試驗發現GBM初診患者接受Rindopepimut與TMZ聯合治療后生存獲益，但TMZ高劑量治療患者表現為更重的毒性作用，如骨髓移植和淋巴細胞減少癥。ACT-Ⅲ試驗中納入65例GBM初診患者接受Rindopepimut與TMZ聯合治療，患者PFS和中位OS均延長，而且85%患者抗EGFRvⅢ抗體滴度升高〔13〕。ACT-Ⅳ試驗〔14〕在期中分析后終止，結果發現Rindopepimut不能延長新診斷膠質瘤患者OS。ReACTⅡ期臨床試驗結果表明Rindopepimut+血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體——bevacizumab能有效延長GBM復發患者PFS〔15〕。除了靶向EGFRvⅢ外，正在進行的臨床試驗使用針對多種抗原的疫苗，例如IMA950試驗〔16〕靶向11種腫瘤相關肽，這種多肽方法可以克服針對單一腫瘤相關抗原時常見的抗原丟失。進一步的臨床試驗(NCT03223103、NCT02864368、NCT02754362、NCT-02722512、NCT02455557、NCT02287428)仍在進行中。

2.3熱休克蛋白(HSPs)疫苗 HSPs能夠廣泛激活先天性和獲得性免疫系統，同時能夠上調MHCⅠ和MHCⅡ抗原表達，誘導抗腫瘤免疫反應。在HSP家族中，HSP70和HSP96具有護送抗原轉交給APC并結合至MHC-Ⅰ類分子上的功能。所以當HSP96結合具有腫瘤特異性的抗原多肽，就能夠誘導特異性腫瘤免疫反應。Ⅰ期臨床試驗發現接受HSP96肽復合物疫苗治療的12例復發GBM中有11例腫瘤部位出現免疫應答，無顯著不良反應；11例免疫應答患者中位OS為47 w，1例無免疫應答患者生存期為16 w〔17〕。Ⅱ期臨床試驗結果發現疫苗與TMZ聯合應用安全有效〔18〕。此外，PD-L1在遷移的骨髓細胞中表達誘導系統免疫抑制，能夠削弱疫苗的作用。在新診斷的GBM患者中MGMT甲基化、Karnofsky表現評分(KPS)和PD-L1表達水平是疫苗有效性的預后指標〔19〕。相關臨床試驗(NCT01814813、NCT02722512、NCT03650257)仍在開展中。

3 ACT

ACT是近年來備受矚目的治療多種惡性腫瘤的免疫治療方法，發展迅速。目前已體現出廣泛的治療范圍，包括多種治療方式：腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)免疫治療、T細胞受體(TCR)治療，嵌合抗原受體(CAR)-T細胞治療。

3.1TIL治療 TIL存在于腫瘤周圍，具有增強的腫瘤特異性。該治療包括腫瘤切除后TIL收集，擴增和白細胞介素(IL)-2刺激，回輸到患者體內4個步驟。TIL治療GBM可能是一種很有前景的治療模式，但由于其潛在的毒性作用和細胞因子釋放綜合征的風險，TIL治療中樞神經系統惡性腫瘤還需要進一步研究。

3.2TCR治療 TCR治療是利用患者外周血中修飾后的T細胞(表達腫瘤特異性α和β鏈)增強對實體腫瘤的抗原識別。備受關注的臨床應用包括靶向T細胞識別的黑色素瘤相關抗原(MART)-1(NCT00509288)、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A3〔20〕和紐約食管鱗狀細胞癌抗原(NY-ESO-1)〔21〕。以上研究發現轉移性黑色素瘤和滑膜肉瘤患者接受TCR治療后出現部分免疫應答細胞替代療法。目前TCR靶向特異性抗原尚未在GBM中進行試驗，但這些抗原也存在于GBM中，因此TCR對其他癌癥的療效值得進一步研究〔22〕。

3.3CAR-T細胞治療 第一代CARs只簡單設計了一個抗原識別域，第二代及其后CARs擁有額外的共同刺激域，如CD28和4-1BB能夠降低激活屏障并優化受體功能。在GBM中，CAR-T細胞靶向3種GBM特異性抗原：人類表皮生長因子受體(HER)2、IL13Rα2或EGFRvⅢ。

HER2是絡氨酸激酶受體，在80%GBM患者中過表達。在2010年一項應用CAR-T細胞靶向HER2Ⅰ期臨床試驗已完成。值得注意的是這些CARs是利用CD28信號域生產并依據其自然識別巨噬細胞(CMV)的能力進行預選，在GBM微環境中可能增強這些細胞的治療效果同時能靶向CMV相關肽。該研究共納入16例HER2陽性的GBM復發患者，二代合成的HER2-CAR CMV-T細胞治療后1例患者表現部分應答，OS>9個月；7例病情穩定，OS達29個月；僅7例患者能夠在治療6 w后采集的血液標本中檢測出HER2-CARs，而且其表達水平持續下降，說明CARs不能在體內擴增〔23〕。目前如何延長CAR-T細胞存活時間仍是一個重要挑戰。

IL-13Rα2是另一個被寄予厚望的抗原，在約75%的GBM患者中表達。Brown等〔24〕進行了一項隊列研究中納入3例高級別膠質瘤(HGG)患者，利用第一代CAR-T細胞針對IL13Rα2經顱內注射至手術部位，患者沒有因缺乏IL13Rα2抗原則被排除。總體上所有3例HGG患者在治療后表現為腫瘤中IL13Rα2表達下調，復發后平均OS為11個月。隨后該團隊利用第二代IL-13Rα2-41BB共刺激CAR-T細胞，通過腔內注射、腫瘤內注射或心室內灌注方法治療復發或難治性HGG患者，該研究仍在進行中，最終結果尚未公布。該研究中1例多病灶復發的GBM患者被證明完全應答，生存7.5個月。該例患者采用腔內灌注治療，直至發現疾病進展，此時房內灌注CAR-T細胞，導致短暫的完全應答，但值得注意的是，復發最終以遠端轉移的形式發生，表達較低水平的IL13Rα2。盡管該研究入組患者例數較少，但為后續研究奠定了基礎。

針對EGFRvⅢ的Ⅰ期臨床試驗，目前仍在進行(NCT01454596)。該研究發現10例患者中有7例在治療后再次手術，3例組織中EGFRvⅢ表達下調，2例完全轉陰。值得注意的是CAR-T細胞治療后腫瘤的手術標本的腫瘤微環境中PD-L1、吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)、轉化生長因子(TGF)-β及FoxP3+Tregs顯著上調。該結果表明腫瘤細胞適應了該CAR-T細胞治療通過激活多種免疫抑制通路發生免疫逃逸。進一步的體內動物模型研究表明，可以通過其他免疫調節療法靶向這種相互免疫抑制從而獲得CAR-T細胞治療的持久抗腫瘤反應〔24〕。

4 病毒療法

病毒治療使用復制能力強的病毒，盡管是減毒或轉基因的，利用溶瘤和非溶瘤機制的優勢，靶向高級別GBM。這些病毒治療劑的臨床應用面臨一個實際的巨大挑戰：既需要能夠通過血腦屏障達到充分的血藥濃度，又需要最大限度地降低全身毒性的風險。對流增強交付(CED)技術已被用來克服這些方面的挑戰。PRECISE治療是截至目前唯一完成的Ⅲ期CED治療GBM的評估。該試驗使用了一種突變的銅綠假單胞菌毒素與重組IL-13結合而成的嵌合細胞毒素cintredekin besudotox，通過CED，該細胞毒素靶向表達IL-13受體的細胞。結果發現與植入Gliadel晶圓相比，復發性GBM的PFS增加，但OS沒有改善〔25〕。這次試驗的失敗可能歸因于不足70%的導管是按照規定放置的；同時，盡管CED組達到了統計所需的總體存活率的顯著性，對照組OS比預期明顯延長，減少了兩者結果的差異。經CED在復發性惡性膠質瘤注入Delta-24-RGD溶瘤病毒的動物試驗和Ⅰ期臨床試驗已完成。研究發現在接受病毒治療2 w后切除的腫瘤組織中仍有活躍的病毒復制，但在治療6 w和2.5年后切除的腫瘤組織中卻沒有發現這一現象。此外，接受腺病毒治療4 w后切除組免疫細胞浸潤增強，T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3表達降低。因為TIM-3在T細胞中表達被認為是T細胞耗竭的標志，說明治療后促進了腫瘤微環境中T細胞的功能。與治療后2 w切除的腫瘤組織比較，治療后4 w切除的組織免疫反應顯著增強，研究者認為腫瘤消退是因為繼發遲發性免疫反應，而不是直接的溶瘤作用〔26〕。

5 未來的研究方向和生物學標志物

即使是在最成功的癌癥免疫治療試驗中，僅一小部分患者獲益。臨床中仍缺乏有效的生物學標志用于預測患者對免疫治療的應答。迄今為止在GBM患者中免疫表型分析受到限制，因為分析過程通常依賴于重復的組織取樣。雖然立體定向活檢的并發癥發生率相對較低，但重復活檢在膠質瘤臨床試驗中并不被認為是標準做法，臨床研究中大多沒有通過組織檢查確認腫瘤復發或進展，而免疫治療引起的炎癥反應很難與腫瘤進展相鑒別。Desjardins等〔27〕報道GBM患者在溶瘤腺病毒(Delta-24-RGD)治療后其T細胞內TIM-3表達水平上調，說明該治療促進了T細胞功能。Ali等〔28〕報道EGFRvⅢ CAR-T細胞治療后切除的腫瘤組織中PD-L1，IDO和TGF-β及FoxP3+Tregs表達水平上調，可能反映了腫瘤的適應性和免疫逃逸。然而，低侵入性的血清生物標志物也得到了有效的應用。在Rindopepimut的Ⅲ期ACT-Ⅳ試驗中，研究人員使用EGFRvⅢ抗體的血清滴度來監測接種后宿主對疫苗的免疫反應程度〔29〕。Guo等〔30〕自體頭部HSP肽疫苗治療在GBM的Ⅱ期試驗中發現，外周血髓細胞PD-L1表達低的患者總體OS為45個月，而表達高的患者OS為18個月。微量透析技術在神經腫瘤學中的應用是對GBM患者免疫監測的補充，具有良好的應用前景。早期使用腦微透析主要針對神經損傷或蛛網膜下腔出血患者，證明了該技術的安全性和可行性。目前利用細胞因子微透析對復發性GBM患者進行免疫監測的研究(NCT03493932)正在進行。

綜上，GBM是一種高度惡性的疾病，目前尚無有效治療手段，因此，尋找新的治療策略迫在眉睫。近年來對GBM的發病機制及其與宿主關系的研究取得了巨大進展。隨著對免疫功能的系統和腫瘤微環境的深入了解，為腫瘤的治療提供了新的靶點。此外，對每個患者特定疾病的深入了解可能有助于改善患者的分類，從而確定最佳的新療法。目前正在開發的多種免疫治療策略具有越來越大的潛力，有望從根本上改變GBM患者的治療方式。