蛋白質組學技術在動物營養與健康研究中的應用現狀

劉曉晨，王亞君

（河南財政金融學院，河南鄭州 450046）

隨著國家力量的強盛和經濟水平的發展，畜牧養殖業也取得飛速發展，但隨著畜牧養殖向集約化、規模化發展，勢必引起養殖環境的惡化，由此帶來的畜產品質量問題已成為困擾人們日常生活的重大問題，這也為畜牧從業者和研究者帶來挑戰。目前解決這一問題的出路就在于動物營養和健康養殖兩方面。蛋白質組學技術為動物蛋白質種類鑒定、功能互作提供了可靠的理論依據，可在動物營養與健康養殖研究領域發揮重要作用。文章在概述蛋白質組學技術具體內容的基礎上，對目前該技術在動物營養研究、動物健康養殖領域內的實際應用做了分析和探討，旨在為這項技術能更好的服務于畜牧養殖行業提供一定的參考和借鑒。

1 蛋白質組學的概述

蛋白質組學指的是運用分子生物學先進的科學儀器和技術手段，對生物體細胞或組織中的蛋白質進行鑒定，并分析當研究對象處于不同生長階段或生理環境中蛋白質所發生的一系列變化，進而探討研究環境和自身因素的改變對細胞代謝、蛋白質功能、互作及對機體整體代謝的影響，力求在蛋白質水平上解釋生命的現象和本質。

1.1 蛋白質組學的研究分類 蛋白質組學研究分類的方法很多，一般情況下都是依據蛋白質組學方面研究的方法策略和研究目的進行分類，在此依據蛋白質組學研究的目的可以將其簡單分為以下幾種類型。

1.1.1 表達蛋白質組學 表達蛋白質組學（也可稱之為差異蛋白質組學），既可以對同一物種組織細胞處于不同狀態時的蛋白質組表達差異進行研究，亦可對不同物種的蛋白質組表達差異進行研究（Walther，等2010）。蛋白質表達差異對鑒定、識別信號轉導過程中的關鍵蛋白質、組織或體液中的生物標志物及藥物靶標等方面有重大意義。

1.1.2 結構蛋白質組學 蛋白質的三維結構是蛋白質生化和功能信息的載體，而結構蛋白質組學正是因此出現的，其主要研究對象是機體蛋白質及其復合物相關的三維結構和細胞器中蛋白質的三維結構，最終的目的是鑒定細胞器中所有的蛋白質，探索蛋白質與蛋白質之間的互作。

1.1.3 功能蛋白質組學 功能蛋白質組學是研究蛋白質生物功能的學科，其研究范圍廣，包含諸多定向和專一性的蛋白質組學研究途徑。某些情況下，也可利用親和色譜分離特殊的亞蛋白質組。功能蛋白質組學技術也可利用技術手段先分離蛋白質復合物和特殊蛋白質，然后分析鑒定分離后的蛋白質，最終獲得機體蛋白質相關信號、某些疾病發生的機理及藥物相互作用等重要的生物信息。

1.2 蛋白質組學操作的基本流程和技術

1.2.1 蛋白質組學操作的基本流程 整體蛋白質是蛋白質組學進行研究的對象，其工作流程如下：將某細胞或組織的總蛋白質降解為肽段，對多肽進行液相色色譜分離，洗脫后的多肽利用在線電噴霧進行離子化，然后使多肽氣進入質譜分析儀檢測，最后通過生物信息學軟件和工具將質譜圖與數據庫多肽匹配，最終對蛋白質進行鑒定和定量分析（Ahrens 等，2010）。

1.2.2 蛋白質組學的基本技術 目前對于蛋白質組學的發展來說，高通量鑒定蛋白質種類的定性研究已逐漸過渡為蛋白質定量表達的具體情況分析，這就是所謂的定量蛋白質組學技術（Quantitative proteomics）。其可在整體水平上對細胞、組織乃至整個機體的全部蛋白質表達和修飾水平的定量信息進行研究，這對系統地理解蛋白質相關功能、解析生理過程、鑒定發現，驗證分子生物標志物等生命科學研究具有重要意義。高通量蛋白質分離技術、大規模蛋白質鑒定技術和生物信息學技術等是定量蛋白質組學的關鍵技術。雙向凝膠電泳（2D-PAGE）及液相分離技術是現如今最常用的蛋白質分離技術。液相分離技術主要有兩種，即反相色譜法（RT-HPLC）和強陽離子交換色譜法，前者根據肽段親疏水性將膚段進行分離，而后者則依據肽段所帶電荷進行區分。進行蛋白質鑒定的主要技術是液相分離技術（包括質譜（MS）技術）。蛋白質通過以上一系列技術的分離鑒定，最終要借助生物信息學的技術和手段進行對比和分析，根據質譜信息獲差異性肽段的信息，然后通過數據庫查詢鑒定蛋白質的種類，目前動物科學研究中主要涉及的蛋白質及多肽數據庫有SwissProt、Uniprot、NCBI、 Gene Index、PDB 等。

2 蛋白質組學在動物營養研究中的應用

2.1 蛋白組學在動物營養原理與調控方面的應用 隨著動物營養學向著分子方向縱深發展，各種新型組學技術（如轉錄組學、宏基因組學、蛋白質和代謝組學等）開始應用到分子營養學中。蛋白質組學是其中具有代表性的一種技術，蛋白質組學技術在動物營養研究中的應用主要集中在揭示動物生長發育規律和營養元素的分子機制和調控機理方面，另外，該技術在營養學中還能為某些營養代謝關鍵調控靶點的發現提供很好的數據支持。Ren 等（2014）發現，在機體應激、免疫和脂質代謝等功能方面有16 個蛋白質表達出現差異。熊嫣（2017）在研究熱應激對肉雞的影響時利用同位素標記定量的蛋白質組學技術研究高溫應激對肉雞下丘腦的影響，結果表明，蛋白質的差異性表達降低了熱應激引起的氧化應激和炎癥反應，同時還可通過釋放神經遞質的負反饋方式來調節激素水平，并參與到內質網降解途徑中。Qin 等（2016）利用標記蛋白質組學技術（iTRAQ）研究發現，有202 個蛋白質豐度發生變化，經過蛋白質功能分析發現，這些蛋白質參與到細胞增殖與凋亡、DNA 的復制、基因表達和mTOR 信號通路等途徑，并且發現特異蛋白質有可能會抑制mTOR 通路，從而降低氨基酸的轉運和細胞增殖。Zhang 等（2016）利用差異蛋白質組學技術研究了兩種豬早期胚胎的肌纖維特性，發現某些肌纖維蛋白（MYH1，TPM4，MYH10 等）、功能性蛋白（CSRP2，OTC 等）以及候選肌原蛋白（H3F3A，HDGFRP2 等）有可能參與到肌纖維形成的調控網絡種。現代商品系肉雞的集約化生產過程往往會導致脂肪大量積存，脂肪的增加勢必影響雞肉品質，有研究發現，在肉雞日糧中添加一定的丙酮酸肌酸鹽，通過對肉雞肝臟組織線粒體和胞漿蛋白質組學的檢測分析發現，丙酮酸肌酸鹽可以下調肝臟中脂肪合成相關的蛋白質表達和膽固醇轉移的蛋白表達，并在一定程度抑制ATP 合成酶，從而有效控制肝臟中的高密度脂蛋白、膽固醇和甘油醇水平。Bondzio 等（2013）在斷奶仔豬飼料中添加2500 mg/kg 氧化鋅，通過差異蛋白質組學技術分析仔豬14 d 的肝臟組織，結果發現，氧化鋅的添加對肝臟血漿蛋白分泌、蛋白質代謝、解毒及氧化還原平衡等相關的功能性蛋白表達有積極作用；而當氧化鋅添加到3000 mg/kg 時，在15 d試驗期后進行小腸黏膜蛋白質組學的檢測分析發現，能量代謝、氧化應激、細胞增殖與調亡相關的蛋白質表達有差異，表明氧化鋅能改善斷奶仔豬腸道氧化還原平衡，抑制細胞凋亡，并且有效緩解因斷奶造成的腸功能紊亂及營養物質吸收障礙。

2.2 蛋白質組學在動物產品品質方面的應用 隨著蛋白質組學技術的發展和完善，在動物產品方面的研究已滲透到（包括肉品質、乳品質、禽蛋等）各個領域，研究目標也從動物產品品質鑒定向產品品質改善方面展開。

2.2.1 蛋白質組學在動物肉蛋品質方面的研究應用 在肉品質方面，該技術主要用于研究肉品質形成的機制、肉品質的改善和肉質檢測等方面。Hamelin 等（2007）對綿羊的4 種不同骨骼肌肌漿蛋白質差異表達譜進行分析研究，結果表明，與氧化代謝相關的蛋白質差異表達決定了肉質的不同，而這些蛋白質主要參與檸檬酸循環。Jia 等（2009）利用雙向凝膠電泳技術（2-DE）研究牛胸部最長肌的肌漿蛋白發現，在活體和新鮮屠宰后的嫩肉中有大量蛋白質 Peroxiredoxin-6 存在，經分析與抗氧化作用相關，并最終建議此蛋白可作為檢測肉質嫩度的指標蛋白。

蛋白質組學技術在禽蛋領域的研究多集中在蛋清、蛋黃中特殊蛋白質的提取，雞蛋品質檢測和品質改善等方面。Qin 等（2016）借助MALDI- TOF MS/ MS 蛋白質組學技術，對儲存于不同溫度15 d 的未受精蛋蛋清蛋白質進行分析鑒定，結果發現，有8 種蛋白在不同溫度下發生表達差異；試驗還發現，隨著溫度升高，卵清蛋白含量逐漸降低；同時高溫儲存后會顯著降低叢生蛋白（Clusterin）的含量，該蛋白質的變化可作為檢測雞蛋品質的生物標記。

2.2.2 蛋白質組學在乳品方面的研究應用 在乳品方面，蛋白質組學技術主要應用于乳品形成機制、乳品質改善與檢測等方面。有研究發現，運用蛋白質組學技術建立一套分析鑒定乳品中β- 乳球蛋白特異性翻譯后修飾位點的技術。針對蛋白質糖基化的修飾作用，Etske 等（2014）研究發現κ- 酪蛋白基因多樣性和糖基化κ- 酪蛋白在乳蛋白中所占比例會影響奶牛個體乳樣中酪蛋白微團的平均大小，并發現兩者有如下關系：糖基化的κ- 酪蛋白比例與酪蛋白微團的平均直徑呈現負相關關系，這可能是一個揭示乳腺中經糖基化翻譯后修飾的κ- 酪蛋白群與酪蛋白微團形成關系的重大發現。Wu 等（2010）利用蛋白質組學技術對豬前后乳腺（MG）分泌的母乳蛋白進行檢測分析研究發現，前乳腺分泌的母乳營養高于后乳腺，主要表現在乳中免疫球和乳鐵蛋白等低豐度蛋白的含量上。

3 蛋白質組學在動物健康研究中的應用

3.1 蛋白質組學在動物疾病研究方面的應用 蛋白質組學能為動物蛋白質種類鑒定分析、功能互作提供一定的理論依據，也能在動物健康養殖研究領域發揮重要作用。病毒、細菌等的病原體感染可引起動物患上多種疾病，嚴重威脅動物健康。關于動物疾病診斷及預防的研究大多停留在表觀層面上，近年來，蛋白質組學在動物病理學及疾病生物學標記檢測中展示了廣闊的應用前景。

沙門氏菌是造成動物消化道感染，引發腹瀉及腸炎等多種疾病的罪魁禍首。Collado-Romero等（2012）研究發現，沙門氏菌感染會影響豬免疫、細胞調亡及病原體介導的細胞浸潤等功能的相關蛋白質表達。Arce 等（2014）利用雙向熒光差異凝膠電泳技術（2D-DIGE）對感染了鼠傷寒沙門氏菌的斷奶仔豬小腸黏膜蛋白組進行分析鑒定，結果發現，鼠傷寒沙門氏菌嚴重干擾了仔豬小腸黏膜的糖異生途徑和Rho GDI/RhoA 信號通路，而角蛋白及中間纖維蛋白的表達變化在感染動物和造成黏膜損傷中至關重要。Matulova 等（2013）采用蛋白質組學技術與轉錄組學相結合的方式對感染沙門氏菌后的雞盲腸進行研究，結果表明，在該細菌感染兩周內，雞盲腸中炎癥反應相關因子的表達呈先上升，14 d 后趨于正常的情況，而免疫球蛋白IgA、IgG 表達量在感染14 d 后顯著上升，揭示雞盲腸中的免疫球蛋白對于抵御沙口氏菌的感染起關鍵作用。

某些疾病在發生過程中常常會導致體液中某些蛋白質的種類和豐度發生改變。利用差異蛋白質組學技術發現其中潛在的生物學標記已成為診斷和預防動物疾病的重要手段之一。有學者對健康和患全身性疾病的豬唾液進行差異蛋白質組學研究發現，在患病組中有10 種特異性蛋白質的表達量顯著上升。豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）是以母豬繁殖障礙和仔豬嚴重的呼吸道癥狀及高死亡率為特征的豬病毒性傳染病。Genini 等（2012）采用蛋白質芯片（PC）結合表面增強激光解析離子化飛行時間質譜（ SELDI- TOF- MS）的蛋白質組學技術檢測PRRS 陽性與陰性豬血清，結果表明，有14 種蛋白質可用于診斷辨別豬是否患上PRRS。豬瘟是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，對豬的健康造成極大威脅，也是豬養殖業發展的攔路虎。Sun 等（2011）采用2 D- DIGE 技術結合MALDI- TOFMS 和LTQMS 技術對豬瘟感染急性期和健康豬的血清進行分析檢測，結果在豬瘟感染急性期的血清中發現有10 種蛋白質表達量發生差異性變化，這些蛋白質涉及的功能包括凝血、抗炎癥因子和血管再生。

3.2 蛋白質組學在動物健康養殖方面的應用 隨著集約化養殖的發展，動物生存環境發生極大改變，很多環境因素（如高密度、氨氣和高溫）都會對動物產生不利影響，對動物健康養殖帶來很大阻礙，利用蛋白質組學技術可以研究當動物處在特殊生存環境和生理狀態，監測組織器官和體液等特殊蛋白質的種類和數量變化，為有效預防和處理相關問題提供理論依據。

高密度的養殖環境很容易導致畜禽舍氨氣濃度超標，從而對動物健康造成影響。張繼澤等（2015）研究發現，在高濃度氨氣環境下，肉雞日增重和采食量等生產性能嚴重下降，肉雞免疫器官和小腸絨毛發育受阻。通過蛋白質組學技術對高氨環境下肉雞小腸黏膜和肝臟組織分析發現，小腸黏膜上由43 個蛋白發生顯著變化，其中上調蛋白主要功能與氧化磷酸化和凋亡相關；肝臟中發現有30 個差異蛋白質，涉及營養代謝、免疫應答、應激與解毒等諸多功能，并且發現兩個慢性肝損傷的標志蛋白GLB1 和AKAP8L。斷奶應激會損傷仔豬腸道黏膜，影響腸道功能，容易導致仔豬發生腹瀉，從而增加死亡率，夏冰（2018）利用SWATH 蛋白質定量技術對斷奶仔豬回腸黏膜蛋白表達譜進行研究，共鑒定到4895 個定量蛋白質，并按照一定的閾值篩選出376 個與斷奶相關的差異表達蛋白質，并在mRNA 水平上進行驗證，進一步深入分析差異蛋白質的生物學功能，從而揭示斷奶應激引起腸道損傷可能的作用途徑。熱應激是目前肉雞集約化生產中備受關注的問題，唐湘方（2015）構建肉雞熱應激模型，利用高通量、非標SWATH 定量技術，成功地在雞肝中鑒定到257 個與熱應激密切相關的蛋白質，通過GO注釋和通路分析對這些蛋白的功能和代謝通路進行分析，最終對肉雞熱應激代謝途徑和緩解熱應激的途徑做出可能的解釋，肉雞通過抑制與磷酸化修飾相關的ERK1/2 信號通路，調節細胞增殖、分化和凋亡修復熱應激損傷，通過上調和下調ACOT1/ACOT8、BHMT/GAMT、P2RX1/KIT 等 特定蛋白質，達到抑制脂肪酸合成、提高神經酰胺水平、促進兒茶酚胺合成的目的，最終幫助肉雞清除自由基，提高神經興奮，增強抗應激能力。

4 結論

蛋白質組學技術作為分子生物學研究的重要技術手段，在動物營養與健康方面的應用有很大優勢，尤其是在蛋白質水平上揭示動物營養原理與調控的分子機制，動物性產品品質改善及檢測方面比較凸顯。同時在動物健康研究中也逐漸被應用于動物逆境生理變化、疾病診斷及健康預警等方面。雖然蛋白質組學技術仍然存在諸如技術缺陷、花費較大等問題，但隨著科學的發展和技術的改進，相信該技術會越來越多地應用于動物營養與健康研究領域，并對學科發展產生巨大的推進作用。