不同原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠模型的優(yōu)缺點

杜思穎，楊晉輝

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 消化內科，昆明 650500)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC，又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化)是一種女性易感的自身免疫性疾病，該病發(fā)生隱匿，進展緩慢，血清學檢查可見自身抗線粒體抗體(antimitochondrial antibodies，AMA)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ-谷氨酰轉肽酶(gammaglutamyl transpeptidase，GGT)升高，病理上以肝內膽汁淤積、門脈區(qū)大量淋巴細胞浸潤、進行性膽管上皮細胞特異性破壞和肉芽腫形成為顯著特征，最終導致廣泛性肝膽管破壞、肝硬化甚至肝衰竭。研究表明，位于線粒體內膜上的丙酮酸脫氫酶復合物的E2亞基(the E2 subunit of pyruvate dehydrogenase complex，PDC-E2)是AMA識別的最主要的自身靶抗原，大多數(shù)患者外周血存在有PDC-E2自身反應性的T細胞[1-2]。近幾年來，PBC發(fā)病率呈上升趨勢，為了更好的進行PBC發(fā)病機制及炎癥進程的研究，尋求新的治療突破口，需要一個理想的PBC動物模型。本文的目的是分析比較幾種應用較廣泛的PBC小鼠模型的優(yōu)缺點，探討目前的模型在疾病研究中存在的缺陷，為研究者模型選擇提供更多的依據(jù)。

1 誘導性模型

1.1 2-辛炔酸(2-octynoic acid，2OA)誘導的小鼠模型

有研究指出，來自PBC患者的自身AMA不僅可與天然脂質化的PDC-E2交叉反應，而且還和許多與硫辛酰具有相似結構的化學異生模擬物交叉反應，其中以2-辛炔酸(2OA)為典型，PBC患者血清顯示出對2-辛炔酸-PDC-E2肽的高Ig反應性，提示這種化學物質在體內具有修飾PDC-E2的潛力，是能夠被AMA識別的半抗原[3-5]。在此基礎上，Wakabayashi等[6]用2OA結合牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)來免疫C57BL/6小鼠和NOD.1101小鼠，皆成功誘導出了類似人PBC的病變，這兩種被誘導的小鼠都表現(xiàn)出自身免疫性膽管炎，典型的自身AMA，血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factoR-α，TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)升高，肝門靜脈區(qū)域CD4+、CD8+淋巴細胞浸潤，肝內小膽管損傷等病理特點，但NOD.1101小鼠出現(xiàn)AMA的時間比C57BL/6小鼠更早，在疾病的第二周開始就可觀察到，而且NOD.1101小鼠的門脈區(qū)除CD4+、CD8+淋巴細胞外，還可見中性粒細胞浸潤及肉芽腫形成，表現(xiàn)出比C57BL/6小鼠更易被外源性物質誘發(fā)出PBC樣病變的特性。

總的來說，用2OA誘發(fā)的PBC模型構建簡單，重建性高，病理特點與人PBC相似，但這種小鼠模型的疾病自然史和嚴重程度不如人類強度高，不包括纖維化改變，并且使用2OA-BSA乳化后腹腔注射可導致不同程度的腹膜炎，這與人PBC有一定差別。此外，應該強調的是，盡管2OA這種異生素在自然界中不存在，但它可以化學合成，并且廣泛應用于香水、口紅、面霜、肥皂、洗滌劑及一些食品添加劑中，這些數(shù)據(jù)為人類PBC的環(huán)境起源提供了說服力。

1.2 聚肌苷-聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，poly I∶C)誘導的模型

Poly I∶C是1型干擾素誘導物，在結構上類似雙鏈RNA(dsRNA)，是Toll樣受體3(toll-like receptor 3，TLR3)的天然刺激物。研究表明，利用腹腔注射poly I∶C的方法免疫C57BL/6雌性小鼠，可以成功建立PBC模型[7-8]，poly I∶C免疫小鼠后8周，在門靜脈區(qū)可檢測到單核細胞，血清AMA陽性小鼠頻率為27.8%；進展至16周，血清AMA陽性頻率增加，肝匯管區(qū)明顯炎性細胞浸潤，浸潤的淋巴細胞積聚在受損的膽管周圍，血清干擾素-α(interferonα，IFN-α)、ALP水平升高，類似PBC的早期改變。這種模型建造方法簡單，所用試劑單一，且由于poly I∶C注射，在這些小鼠中檢測到高水平的IFN-α和其他促炎細胞因子，受到許多科研工作者的青睞，但該種方法需4個月才能使小鼠發(fā)展成PBC，血清AMA抗體滴度較低，門靜脈炎癥程度輕，未見嗜酸性粒細胞浸潤及纖維化或橋接樣壞死改變，不及人類PBC嚴重，只適用于早期病變的研究。

1.3 2OA與poly I∶C聯(lián)合免疫C57BL/6小鼠模型

基于對以上兩種造模方法的觀察，加上越來越多的研究表明環(huán)境和/或感染因子可以加劇自身免疫反應，故有研究提出，運用2OA與poly I∶C聯(lián)合免疫是否會改變疾病進程?為了驗證這一假說，Ambrosini等[9]人使用這兩種藥物進行了聯(lián)合免疫實驗，發(fā)現(xiàn)與2OA免疫組比，聯(lián)合免疫組中poly I∶C給藥加劇了2OA免疫小鼠肝中的自身免疫性膽管炎，包括CD8+T淋巴細胞以及血清IL-6、IL-12、IFNγ、TNF-α等促炎細胞因子的顯著增加，更為重要的是，該種模型有纖維化證據(jù)，肝組織學檢查可見嗜酸性粒細胞浸潤和橋接樣纖維化改變，與人PBC組織學表現(xiàn)非常相似。與單獨用2OA免疫組和單獨用poly I∶C免疫組相比，這種聯(lián)合免疫小鼠的實驗方法較為復雜，且同樣會并發(fā)腹膜炎，但該種實驗方案周期短(8周)，血清內AMA抗體滴度高，肝病理學檢查有纖維化改變，可用于PBC早期及晚期病程的研究。2OA與poly I∶C聯(lián)合免疫小鼠成功建立PBC模型的事實說明，PBC疾病的發(fā)生除了自我耐受性的破壞之外，還需要在疾病進程中產生第二次“命中”，符合自身免疫性疾病的“多重打擊”假說，更真實的模仿了人類PBC疾病。

1.4 抗線粒體抗體M2抗原誘導的小鼠模型

PBC特征性的血清學指標是自身AMA的出現(xiàn)，也是PBC患者最早出現(xiàn)的變化之一，甚至在發(fā)病前即可檢測到[10-11]。AMA一共有M1-M9九個亞型，其中只有M2型為PBC特異性抗體，M2的靶抗原是2-氧代酸脫氫酶復合體的一些組分，主要包括PDC-E2，OGDC-E2和BCOADC-E2三種。抗線粒體抗體M2抗原誘導的模型是指利用基因工程的方法克隆表達M2型抗體的3個靶抗原，并將其連接成抗原蛋白三聯(lián)體，免疫C57BL/6小鼠建成的模型[12]。這種小鼠模型非常容易誘導出針對M2型自身抗原的抗體，血清AMA抗體滴度高，ALP水平增加，而谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)無明顯變化；胃、肌肉和腎組織沒有明顯的損傷，而肝有明顯的病理變化，包括膽管周圍單個核細胞浸潤，膽管上皮細胞變性壞死，基底膜不完整，小葉間膽管損傷或增生等，符合PBC的肝特異性改變。雖然這種模型免疫后66周才觀察到病變，與人PBC的慢性進程一致，但該種方法耗時長，技術要求高，沒有纖維化形成，且建成PBC模型時小鼠年齡已太老，無法進行下一步的觀察或治療研究，限制了該模型的廣泛使用。

2 基因修飾模型

2.1 dnTGF-βRII小鼠模型

轉化生長因子-βII型受體顯性失活型(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type II，dnTGF-βRII)小鼠模型是在CD4啟動子的控制下，轉基因小鼠過表達TGF-βII型受體(TGF-βRII)的顯性失活形式，自發(fā)地出現(xiàn)PBC樣損傷[13]。該模型很好地模擬了人PBC的幾個關鍵特征，包括自發(fā)產生AMA、100% AMA陽性、門靜脈內有廣泛的CD4+和CD8+淋巴細胞浸潤、血清IFN-γ和TNF-α水平升高以及肝內小膽管損傷等。在眾多模型中，dnTGF-βRII小鼠模型是具有與PBC最接近的血清學特征的模型，被廣泛使用[14]。同時我們也不能忽視dnTGF-βRII小鼠模型尚存在的缺陷:第一，該方法沒有顯示出dnTGF-βRII小鼠患PBC的女性優(yōu)勢特征，缺少雌性小鼠動物模型；第二，TGF-β是一種重要的免疫調節(jié)因子，其可誘導來自幼稚CD4前體細胞的Foxp3+Treg的發(fā)展，在細胞的生長發(fā)育以及抑制主要免疫性細胞而促進調節(jié)性細胞的生成方面發(fā)揮重大的作用，該模型TGF-β信號的缺失引起了其他疾病的出現(xiàn)，如炎癥性腸病、壽命期縮短等；第三，dnTGF-βRII小鼠并不表現(xiàn)出循環(huán)IgM的持續(xù)增加，相反，它表現(xiàn)出IgA的增加；第四，不存在嗜酸性粒細胞浸潤和肉芽腫形成。另外，dnTGF-βRII小鼠自發(fā)出現(xiàn)這些PBC樣損傷表明TGF-β信號傳導的缺乏或異常活化參與了PBC的發(fā)病機理并導致了免疫調節(jié)失衡和自身耐受性的喪失，但具體機制有待進一步研究。

2.2 IL-2Rα(CD25)-/-小鼠模型

IL-2是具有多種生物活性的細胞因子，其與IL-2R結合的信號傳導有助于維持體內T細胞耐受，調節(jié)Treg細胞的穩(wěn)態(tài)和抑制功能[15]。白細胞介素2受體α(IL-2Rα/CD25)表達缺陷的小鼠外周血中Treg細胞減少，且產生的特異性AMA可結合到PDC-E2內部的脂酰結構域，與人PBC一致，除此之外，該模型小鼠還表現(xiàn)出100% AMA陽性，80%ANA陽性，血清IFN-γ、TNF-α、IL-2水平增加，肝匯管區(qū)淋巴細胞浸潤，輕度膽管破壞和界面性肝炎等癥狀[10，16]，符合PBC樣損傷特征。值得注意的是，IL-2Rα(CD25)-/-小鼠模型沒有顯示出嗜酸性粒細胞增加和肉芽腫形成，也沒有提及血清內膽紅素和膽汁酸的改變，而且還出現(xiàn)了其他類型的自身免疫性疾病，包括淋巴組織增生性自身免疫性疾病、炎癥性腸病和溶血性貧血等，這也是此種小鼠壽命較短的原因，大多數(shù)小鼠在出現(xiàn)嚴重的肝病變之前都因發(fā)生重度貧血死亡，不利于進行PBC晚期病變的研究，而且非PBC特異性模型。

2.3 NOD.c3c4小鼠模型

在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型的研究過程中發(fā)現(xiàn)，將染色體3和4上的胰島素依賴性糖尿病阻抗位點B6/B10重組入NOD小鼠內，可阻止1型糖尿病發(fā)生并且出現(xiàn)伴有大量淋巴細胞浸潤的自身免疫性膽管疾病，因此將這種小鼠命名為NOD.c3c4小鼠。這種小鼠在第8～9周即開始產生自身AMA且可特異性的與PDC-E2的內部硫辛酰結構域結合，血清學檢查可見50%～60% AMA陽性，80%～90%ANA陽性；在顯微鏡下，NOD.c3c4小鼠表現(xiàn)出特定的肝病變，包括上皮樣肉芽腫形成，NSDC樣病變，嗜酸性粒細胞浸潤和早期纖維化，受累的膽管上皮中有CD3+，CD4+和CD8+T細胞浸潤等，符合PBC征象[17]。值得一提的是，NOD.c3c4小鼠不僅存在肝內膽管的非化膿性膽管炎樣損傷，同時還累及肝外膽管，90%的小鼠在30周時會出現(xiàn)肝外膽管囊性擴張，當膽管擴張到一定程度，膽管上皮細胞就會脫落，最后發(fā)展為致死性的膽道梗阻[17-18]，與人PBC不符。

2.4 Scurfy小鼠模型

Scurfy小鼠即Foxp3基因突變的小鼠。Foxp3是Treg細胞特異的轉錄因子，是由nTregs獨特表達并且是其發(fā)育所必需的，因此Foxp3基因的突變或消失將會嚴重影響調節(jié)性T細胞主動維持自身免疫耐受的功能，最終導致免疫失調和自身免疫性疾病的發(fā)生[19-21]。在Scurfy小鼠中，由于編碼轉錄因子Foxp3的基因移碼突變，使Foxp3+Treg細胞功能完全缺陷，最后自發(fā)地發(fā)展出PBC樣病變。Scurfy小鼠在第3～4周時就顯示出100% AMA陽性，血清內TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23細胞因子顯著升高，肝匯管區(qū)有中度至重度淋巴細胞浸潤，肝內小膽管損傷等特點[22]。遺憾的是，該模型并沒有提及有關膽汁淤積的指標，且此種小鼠壽命極短，僅有4周左右，雄性小鼠沒有生育能力，不利于進行PBC進展相關的機制研究。

2.5 Ae2a，b-/-小鼠模型

Cl-/HCO3-陰離子轉換器2(Cl-/HCO3-anion exchanger 2，Ae2)是具有細胞內pH調節(jié)和跨上皮酸-堿轉運功能的離子通道，能夠幫助促胰液素刺激的膽汁碳酸氫鹽有效排泄[23]，Ae2a，b-/-小鼠即Cl-/HCO3-陰離子轉換器2基因敲除的小鼠。該模型小鼠大約有三分之一表現(xiàn)出廣泛的門脈炎癥，約有80%出現(xiàn)AMA陽性，效應性T細胞增多，調節(jié)性T細胞減少，血清IL-12和IFN-γ分泌明顯，IgM、IgG及ALP顯著增加，表現(xiàn)出PBC的一些特征[24]。與人不同的是，這種小鼠具有自發(fā)脾大的現(xiàn)象，伴有脾細胞內pH升高，小鼠個體間差異大，門靜脈炎癥有輕度到重度不等，且很難飼養(yǎng)，對PBC研究有一定的局限性。但同時應注意，Ae2a，b-/-小鼠模型的建立提示了Ae2在膽管功能和免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中的作用，為PBC的發(fā)病機制提供了一個新的線索，也為新的免疫調節(jié)策略提供新思路。

綜上所述，PBC樣肝病變雖然能在實驗動物中誘導，但無論哪一種誘導模型都存在一定的缺陷，這是由于人類PBC復雜而神秘的病因難以被完全復刻，且不能排除人PBC中涉及的參與因子可能不存在或不能在小鼠模型中持續(xù)模仿，這使得PBC模型建造面臨巨大的挑戰(zhàn)。盡管已有研究報道了在18～24個月時超過一半的雌性C57BL/6小鼠在肝中可自發(fā)的發(fā)展出PBC樣膽管炎病變[25]，但這種自然發(fā)生PBC的小鼠模型發(fā)現(xiàn)病變時年齡已太老，不利于長期進行研究，也無法測試新藥和新治療方案的效果，難以被廣泛使用。目前，雖然已有相當多的科學證據(jù)揭示了PBC獨特的臨床，實驗室，免疫學和組織形態(tài)學特征，但由于PBC患者長期無癥狀，其早期免疫事件及發(fā)病機制仍然模糊不清，迄今尚未尋找到可以徹底治愈PBC的方法，熊去氧膽酸作為PBC的一線治療，能明顯降低ALP水平，提高患者生存率和降低肝移植的必要性，但超過1/3的患者治療無應答[26]，因此，積極尋找建立無限接近于人PBC的動物模型，進行PBC早期細胞和分子事件研究及創(chuàng)新治療策略的開發(fā)仍然是科研工作者們努力的方向。