基于透明標本研究巴西紅耳龜幼體骨骼系統

黃鳴翔，郭 婷，荊 洵，黃誠彧，周 玲，劉 敏

(華中農業大學動物醫學院，湖北 武漢 430070)

巴西紅耳龜(Red-eared slider，Trachemysscriptaelegans)，在動物界屬龜鱉目澤龜科滑龜屬，是水棲龜，頭側中部的鼓膜上有桔紅色或暗紅色的橢圓形斑[1]。透明標本是用化學和物理的方法，使軟組織的折光率和透明劑的折光率相近，從而使軟組織透明，骨組織清晰顯現[2]。巴西紅耳龜幼體骨塊比較小，骨與骨之間的軟骨成分比較多，不易于做成骨骼標本，且尚未發現通過制作龜透明標本來研究骨骼系統的報道。故本試驗擬采用透明標本制作技術來研究巴西紅耳龜幼體的整體骨骼形態結構以及各骨塊之間的位置關系，既可建立巴西紅耳龜透明標本的制作方法，又可確定其骨骼系統的解剖學特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 幼齡期的巴西紅耳龜。

1.2 試劑及工具 1%氫氧化鉀(KOH)、茜素紅溶液、3%過氧化氫(H2O2)、梯度(25%、50%、75%和100%)丙三醇、解剖刀柄、刀片、眼科鑷子、量筒、容量瓶及廣口瓶等。

1.3 制作方法

1.3.1 處理材料 將龜放入充滿乙醚的容器中，使其吸入過量乙醚致死。用解剖刀在龜的后肢皮膚上切一個5～8 mm的口子，用鑷子將內臟全部取出。

1.3.2 固定 將標本放入95%的乙醇中固定7 d，用玻璃板壓住，使其完全浸沒，隔2～3 d換液。

1.3.3 脫脂 將固定后的標本移入丙酮中，脫脂3 d。

1.3.4 透明 使用1% KOH將標本浸泡3～5 d，至肌肉及龜殼呈半透明狀，并將龜殼上的角質盾片剝落。

1.3.5 染色 移至飽和茜素紅溶液中，骨骼被染為紫紅色為止，約3～5 d。

1.3.6 脫浮色 移至3% H2O2中脫浮色，能清晰看到骨組織紫紅色為止，一般需要2～3 d。

1.3.7 梯度透明 依次移入25%、50%及75%的丙三醇中各浸泡3 d，至無多余的顏色浮出、骨組織清晰可見為止。

1.3.8 保存 移入100%的丙三醇中進行保存。

2 結果

2.1 染色結果分析 本試驗制作的巴西紅耳龜透明標本，形態完整染色均勻，可觀察到巴西紅耳龜的頭部、四肢、龜殼、尾部、身體中部被茜素紅染成了紅色，說明這些部分含有能夠與茜素紅特異性結合的鈣成分，為硬骨組織，其余的部分則透明無浮色，為軟骨組織、肌組織和其他結締組織。見中插彩版圖1、2。

2.2 骨骼系統觀察 本試驗通過制作透明骨骼標本，發現巴西紅耳龜骨骼可分為頭骨、脊柱、肋骨和附肢骨。同時，龜鱉目是爬行綱中最為特化的一類，背腹具殼，是一種被動的保護性適應[6]。

2.2.1 頭骨 面區短而窄，眼后則顯著擴大，整個頭骨較寬而扁平(見中插彩版圖1A)。

2.2.2 脊柱 包括頸椎、軀椎、薦椎和尾椎。頸椎未與龜殼愈合，但由于龜殼的遮擋，頸椎無法清楚的觀察到。軀椎與背部的髓板愈合，髓板是骨質的結構，會被茜素紅染上顏色，覆蓋在軀椎上。薦椎遠端的膨大與腰帶相連。尾椎有20枚左右，從前往后逐漸變小。

2.2.3 肋骨 龜類的肋骨數比較少，其中有8對緊密愈合于背殼的肋板。見中插彩版圖1A，可以清晰看到與肋板愈合的8塊肋骨和薦尾椎相連的比較小的肋骨，且中間的肋骨較長，兩邊的肋骨較短。

2.2.4 附肢骨 (1)前肢骨：分為肱骨、橈骨、尺骨、腕骨、掌骨和指骨(見中插彩版圖1B)。①肱骨粗壯，彎成弓形，中段稍圓，兩端微隆。②橈骨與尺骨并列，遠端比近端略寬。尺骨較橈骨略微粗壯，近端比遠端略寬(見中插彩版圖1B)。③腕骨為不規則顆粒狀，互相嵌合(見中插彩版圖1B)。④掌骨有5枚，圓片狀，前凹形。⑤指數13枚，各排指骨數為2、3、3、3、2(見中插彩版圖1B)。(2)后肢骨：分為股骨、脛骨、腓骨、跗骨、跖骨、趾骨(見中插彩版圖2B)。①股骨略彎，中段細圓，兩端擴大。②脛骨與腓骨并列，腓骨比脛骨細弱，中間靠合形成長條形的間隙，遠端與跗骨相接(見中插彩版圖2B)。③跗骨中包括距骨和跟骨，脛骨一側為距骨，腓骨一側為跟骨，較小。④跖骨5根，粗細長短不一，第1根較粗，第4、5根較短(見中插彩版圖2B)。⑤趾骨13枚，各排的數目為2、3、3、3、2(見中插彩版圖2B)。

2.2.5 龜殼 龜殼由背部和腹部組成：背殼和腹殼。(1)背殼：向外凸的橢圓形。從中插彩版圖1 A和1C中可清晰發現背殼有3列骨板：①圍在邊緣的11對緣板；②由前至后順背中線排列的，近方形的一列髓板，大部分與下面的脊椎愈合。髓板的最前面一塊稱為頸板，最后一塊又稱為臀板或者后髓板；③位于緣板和髓板之間，長方形的8對肋板，排列為左右兩列并與下面肋骨緊密聯合。(2)腹殼：平板狀，腹殼骨板是由成對的上腹板、舌腹板、下腹板、劍腹板以及前中位的單塊內腹板構成(見中插彩版圖2A、2C)。

3 小結

3.1 本試驗通過與四爪陸龜[4]、幼發拉底河軟殼龜[5]的骨骼系統相比較，通過透明標本的制作和觀察驗證了巴西紅耳龜的骨骼系統與其他龜類大體相同。均可見頭骨、脊柱、肋骨、附肢骨和龜殼。龜殼可分為背殼和腹殼，背殼中包含軸向骨骼元素：軀椎和肋骨[7]。脊柱包括頸椎、軀椎、薦椎和尾椎。附肢骨包括肩帶、前肢骨、腰帶、后肢骨等[4]。巴西紅耳龜的部分骨骼數目與其他龜類仍有一些差異。其掌骨和跖骨均為5枚，指(趾)骨均為13枚。幼發拉底河軟殼龜掌骨和跖骨為5枚，指骨17枚，趾骨15枚[5]。四爪陸龜的掌骨和跖骨為4枚，指骨6枚，趾骨8枚[4]，各指(趾)的節數略有差異。

3.2 在以往文獻中未發現龜類透明標本制作的相關信息，根據劉萬勝等[9]研究結果進行改進，設計了一套較合理的制作巴西龜幼體透明標本的方法。(1)用梯度乙醇(75%，85%，95%)脫水要比直接用95%的乙醇脫水效果好，能降低劇烈脫水對龜身體造成的傷害。(2)脫脂要充分，否則會影響后面步驟透明的效果。(3)透明的時間需視情況而定。過長會使骨骼松散，過短則影響染色效果。在透明的過程中，龜殼外層的角質盾片會被軟化脫落。(4)巴西紅耳龜較難染上色，所需時間稍長，一般是3～5 d。不要將茜素紅配置成過飽和，會使標本染色過深，導致后續步驟脫浮色困難。(5)不同于雛雞、青蛙等透明標本制作[8-9]采用的脫浮色試劑(梯度酒精和梯度丙三醇)，我們發現H2O2脫浮色效果更好，周期更短。缺點是會產生氣泡，可以用注射器抽取消除。

3.3 本試驗制作的標本頭骨染色不太清晰，難以具體辨認頭骨各部位?？赡苁窃诎胪该?、染色和脫浮色這一系列過程中，標本未用重物固定好，導致標本頭部漂起，未完全沒入液面，未經歷這些步驟或經歷時間不夠。另外，有些骨位于龜殼內，部分結構被龜殼或肌肉遮擋，難以觀察其完整結構和確定其數目。如標本肩帶(肩胛骨、烏喙骨)、腰帶(髂骨、坐骨、恥骨)、頸椎、軀椎、尾椎等。

龜作為一種較難以普通解剖方法進行骨骼研究的生物，尤其幼體骨骼發育不充分且個體較小[10]。透明標本這一種標本制作方法為研究動物龜幼體骨骼系統提供了實踐基礎，為胚胎學、解剖學提供了直觀而清晰的形態學素材。其應用方面較為廣泛，值得在研究中不斷進行嘗試改進。