巨蠣屬牡蠣DNA 序列的比較及鑒定

彭 敏，羅 邦，朱威霖，楊春玲，趙永貞，李強勇，劉青云，曾地剛，李 旻，陳秀荔

（1.廣西壯族自治區水產科學研究院// 2.廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室，廣西 南寧 530021）

牡蠣屬雙殼綱（Bivalvia ）翼形亞綱（Pterimorphia）珍珠貝目（Pterioida）牡蠣科（Ostreidae），是分布廣、種類多、產量高的一種經濟貝類[1-2]，在近岸生態系統中扮演重要角色[3]。牡蠣具有廣棲息性，外部形態常隨生活環境不同而變化，在所有海洋無脊椎動物中，牡蠣是最常見的、形態變異大的一類[4]，通過形態來確定牡蠣的分類地位往往會造成錯誤和困惑[5-9]。因此，尋找快速有效的種類鑒定方法，對牡蠣的遺傳改良、種質資源管理與保護等具有重要意義。目前，線粒體及核糖體DNA序列是鑒定和分類巨礪屬牡蠣的常用方法，例如Klinbunga等[10]用線粒體DNA標記對泰國的Crassostrea belcheri、艾氏牡蠣（Crassostrea iredalei）和僧帽牡蠣（Saccostrea cucullata）進行分類。Mazon-Suastegui等[11]報道稱28S rDNA是商業上重要的牡蠣鑒定的替代標記。Cordes等[12]報道了基于線粒體DNA標記區分9種巨蠣屬牡蠣物種。Diaz等[13]根據5S rDNA基因擴增實現對Crassostrea和Ostrea oysters的物種鑒定；Lam等[14-15]基于線粒體DNA方法鑒定出一種新的巨蠣屬牡蠣和印度西太平洋巖牡蠣；Wang等[7]基于線粒體16S rRNA和核28S rRNA基因的DNA序列對近江牡蠣進行分類；楊葉欣等[16]采用RAPD分子標記和rDNA-ITS1序列分析對近江牡蠣兩個野生種群的遺傳多樣性分析；李詠梅等[17]進行了欽州灣牡蠣線粒體16S rRNA和COⅠ基因片段的序列變異分析。此外，還有非基因方法來研究鑒定和分類，如Wang等[18]采用高分辨率熔解分析法研究了來自中國的五種巨蠣屬牡蠣的鑒定。DNA序列分析是DNA多態分析技術中最有效的方法之一，是各類生物的遺傳、進化和生態等領域研究的重要工具。核糖體DNA轉錄間隔子序列（Internal transcribed spacer，ITS）進化速度快、在種和種下水平變異豐富，是重要的分子標記，在無脊椎動物的分子系統學研究中，ITS 區序列已得到了廣泛的應用，為解決一些長期存在的分類學問題提供了新的重要標記[19-25]。目前關于采用線粒體DNA片段（COI、12S、16S和tRNAs）以及核糖體RNA基因轉錄間隔子序列ITS-1、ITS-2和ITS對巨蠣屬牡蠣進行鑒定和分類鮮有報道。針對牡蠣外殼形態的多變性，為尋找合適的用于區分牡蠣的DNA條形碼（DNA barcodes），本研究通過對線粒體DNA片段（COI、12S、16S和tRNAs）以及核糖體RNA基因轉錄間隔子序列（ITS-1、ITS-2和ITS）的比對分析，對我國沿海分布的香港牡蠣（Crassostreahongkongensis）、有明牡蠣（Crassostrea ariakensis）、葡萄牙牡蠣（Crassostrea gigas angulata）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas gigas）、熊本牡蠣（Crassostrea sikamea）、巖牡蠣（Crassostrea nippona）和艾氏牡蠣（Crassostrea iredalei）等7種巨礪屬牡蠣進行分子系統學研究，旨在尋找出快速有效的種類鑒定和分類方法，以期闡明其系統關系和種類區分，進而為牡蠣的遺傳改良、種質資源管理與保護提供依據和指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究分別在廣西欽州、防城、廣東陽江、山東萊州灣和福建等地收集香港牡蠣、有明牡蠣、葡萄牙牡蠣、太平洋牡蠣和熊本牡蠣等5種牡蠣樣本各10個，分別對其進行擴增測序。

利用GenBank公布的與本研究同屬或同種的牡蠣線粒體全基因序列33條及全長ITS序列25條比對分析，這些序列劃屬于7個巨礪屬種（表1）。

表1 所用樣品的相關信息Table 1 Related information on the samples used in this study

1.2 DNA 的提取、擴增與測序

采集牡蠣閉殼肌按醋酸銨法提取牡蠣總DNA[26]。本研究選用4段線粒體DNA片段和3段核DNA片段對我國采集的香港牡蠣、有明牡蠣、葡萄牙牡蠣、太平洋牡蠣和熊本牡蠣樣本進行PCR擴增，tRNAs片段擴增界于12S和16S之間，其引物根據Genbank中巨礪屬線粒體DNA序列設計相應的擴增引物，而COI、16S、12S、ITS1、ITS2和ITS均采用貝類基因通用引物，本研究所采用的引物見表2。

表2 PCR擴增K片段及引物序列Table 2 Primer sequence for PCR

1.3 DNA序列處理及數據分析

采用SeqMan程序，COI、16S、12S片段拼接后去除引物區及不穩定區域，tRNAs、ITS片段測序拼接后去除兩端序列，ITS1和ITS2序列直接用ITS序列切除獲得；在GenBank下載的序列與本實驗樣品的測序結果比對后獲得相應的序列。應用MEGA4.1軟件計算基于Kimura雙參數距離模型（K2P）的序列種間和種內遺傳距離[27]；通過Wilcoxon檢驗分析不同序列之間的變異性[28]；通過比較序列種內和種間變異的分布評估條形碼間隙（barcoding gap）；采用BLAST和Nearest Distance考察序列的鑒定成功率。

2 結果與分析

2.1 7個基因片段的序列分析

由表3可知，50個樣本的7個片段均全部PCR擴增成功，COI、16S、12S和tRNAs PCR擴增產物均可直接測序成功，ITS1、ITS2和ITS直接測序成功率極低，故ITS PCR產物電泳切膠回收后克隆，所得的克隆子均測序成功，ITS1和ITS2序列直接用ITS序列切除而得。

各條序列的長度從277～ 1 203 bp不等，去除兩端12S和16S部分序列后獲得的tRNAs序列最短，為277～ 306 bp，ITS序列最長，為1101～ 1 203 bp。tRNAs序列變異位點最多，為51.4%，12S變異位點最少，為10.3%。各序列的GC含量也不相同，ITS1序列的GC含量最高，達到58.0%，tRNAs序列的GC含量最低，A+T含量高達71.4%。

2.2 7個基因片段序列的差異分析

對獲得的巨礪屬牡蠣不同序列的平均種間距離、平均種內距離、最小種間距離和最大種內距離進行分析。結果如表4所示，在種間最小距離中，tRNAs序列最大，COI序列次之，16S序列最小，種內最大距離中，同樣是tRNAs序列最大，COI序列次之，12S序列最小，ITS1的種內最大距離過了種間最小距離。

表3 7個基因片段的序列分析結果Table 3 Sequence analysis results of seven DNA fragment

表4 7個基因片段在巨蠣屬種內種間變異Table 4 Inter-specific variation and Intra-specific variation in seven gene fragments in Crassostrea

亞種間及亞種內不同序列的差異分析結果如表5，亞種間最小距離序列差異對比發現，tRNAs序列差異最大，COI次之，而12S、ITS、ITS1、ITS2亞種間最小距離的序列差異為0；亞種內最大距離對比發現，ITS1和ITS差異最大，12S、ITS、ITS1和ITS2的亞種內最大距離序列差異變化均超過了亞種間最小距離的序列變化差異。

表5 7個基因片段在巨蠣屬亞種內亞種間變異Table 5 Inter-subspecific variation and Intra-subspecific variation in seven gene fragments in Crassostrea

2.3 7個基因片段序列變異程度比較

Wilcoxon秩和檢驗結果（表6、7）表明，無論是種間變異還是種內變異，最大的都是tRNAs序列，COI序列次之，12S序列最小。在亞種間變異，最大的是tRNAs序列，COI次之，12S序列最小，而在亞種內變異，ITS1序列最大，ITS次之，12S序列最小。tRNAs和COI序列較其它序列具有極顯著性差異，反映出各序列（亞）種間的變異情況是tRNAs和COI較其它序列變異更快，所得結果與表5中（亞）種間距離值結果一致。

表6 7個基因片段在種間種內差異的Wilcoxon秩和檢驗Table 6 Wilcoxon Rank and Test of Inter-specific variation and Intra-specific variation in seven gene fragments

表7 7個基因片段在亞種間亞種內差異的Wilcoxon秩和檢驗Table 7 Wilcoxon Rank and Test of Inter-subspecific variation and Intra-subspecific variation in seven gene fragments

2.4 7個基因片段在種內變異和種間變異分布

巨礪屬不同序列種內變異和種間變異分布圖（圖1）顯示，在種層面上，tRNAs和COI序列種間變異與種內變異之間有明顯的條形碼間隙，12S、16S、ITS和ITS2的種間變異與種內變異沒有重疊，但也不存在條形碼間隙，而ITS1的種間變異與種內變異出現重疊，不利于區分物種。在亞種層面上，12S、ITS、ITS1和ITS2的亞種間變異與亞種內變異出現重疊，16S的亞種間變異與亞種內變異雖沒有重疊，但也不存在條形碼間隙，而tRNAs和COI序列亞種間變異與亞種內變異之間有明顯的條形碼間隙，有利于區分亞種。

圖1 （亞）種內和（亞）種間變異分布Fig.1 genetic variation distribution of species and subspecies

3 討論

巨牡蠣屬的分類已經研究了很多年，盡管已引入分子鑒別方法，但是爭論仍然不斷，其中1 個典型例子就是C.gigas和C.angulata的分類關系。一些研究者認為這2 個是不同的種，但是遺傳上近緣關系很近[29]，另外有人則表示這2 個應該為1 個種[30-31]，還有人將福建等南方海域廣泛分布并大量養殖的葡萄牙牡蠣命名為福建長牡蠣（C.gigas angulata），并將其與我國長江口以北海域廣泛分布并大量養殖的長牡蠣（C.gigas gigas）由種間關系修訂為亞種關系[32]。本研究采用第三種觀點對我國巨礪屬牡蠣進行分析。

理想的DNA條形碼序列應具備明顯的種間變異，同時種內變異要足夠小，并在兩者間形成一個明顯的間隔區，即條形碼間隙[33]，并且應該能夠使用單引物對其進行擴增，通過雙向測序得到高質量的序列[34-35]。Hebert等認為種內與種間的標準差異應為種內平均遺傳距離的10倍（10倍法則）[36]。另外有一些研究者則建議當計算條形碼間隙時應用最小種間距離取代平均種間距離[37]。本研究對7個不同牡蠣品種的tRNAs、COI、16S、12S、ITS、ITS1和ITS2序列進行分析。分析結果表明，在種層面上，7種序列的種內種間平均距離均超過種內平均距離10倍以上，但若用最大種內距離和最小種間距離取代平均種內距離和平均種間距離，最大倍率為tRNAs（4.25）隨后是12S（3.52）和COI（2.96）最低為ITS1，僅為0.67，10倍距離法是不能滿足。在亞種層面上，tRNAs、COI、16S的種內種間平均距離均超過種內平均距離10倍以上，而最小種間距離與最大種內距離最大倍率為COI（2.62），隨后是tRNAs（1.95），12S、ITS、ITS1和ITS2最小種間距離與最大種內距離比值為0，無法區分亞種。在植物鑒定中，表現較好的ITS、ITS1、ITS2常作為各種植物鑒定的候選DNA條形碼序列[38-39]。然而，在本研究中巨蠣屬牡蠣種內與種間遺傳差異中ITS1存在重疊，而ITS、ITS2與12S無條形碼間隙，即使C.gigas gigas和C.gigas angulata有共同序列也難以區分這些種，因此這些基因片段不適合用作種水平的物種鑒定。16S盡管也有較高的遺傳分化率，但在（亞）種間與（亞）種內距離分布圖中沒有明顯的條形碼間隙，而16S和12S遺傳變異在本研究中7種序列中最小，隨著采樣范圍的擴大和樣品數量的增加，（亞）種內的遺傳距離很可能也隨之增大而出現重疊。相較而言，tRNAs、COI比12S和16S更適合巨礪屬牡蠣物種鑒別，與王青[40]的研究結果認為COI優于16S一致，與劉凱凱等[41]認為COI可以快速鑒定巖牡蠣和長牡蠣結果一致，但他們認為16S與COI均可快速鑒定巖牡蠣和長牡蠣。

4 結論

在鑒別巨蠣屬牡蠣種以及亞種方面本研究中表現最好的是tRNAs，其次為COI 序列，tRNAs比COI 序列擁有更高的變異，但從巨礪屬牡蠣物種來說COI 序列更適合物種鑒定，COI 引物具有更廣的通用性[42]。在鑒別巨礪屬牡蠣方面tRNAs 具有更高的變異性和更大的條形碼間隙可作為COI 序列的輔助序列。本研究證實了tRNAs 和COI 序列不僅可用于種間的鑒定，也可用于亞種間的鑒定。該研究可用于闡明牡蠣系統關系和種類區分，進而為其遺傳改良、種質資源管理與保護提供依據和指導。