應用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依賴性皮炎模型及其皮膚病理變化觀察

朱睿 陳茜 徐瑞雪 楊文佳 陳洪鐸 徐天華

[關鍵詞]激素依賴性皮炎;兔模型;丙酸氯倍他索乳膏;病理變化

近些年來激素依賴性皮炎的患病率逐年增加，這可能與激素的不正當使用及應用含有激素的護膚、美容產品有關[1]。臨床表現為皮膚干燥、脫屑、瘙癢、片狀紅斑、萎縮和對外界刺激敏感等癥狀。但是目前因為倫理問題具體皮膚病理表現尚未明確。本實驗通過應用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依賴性皮炎模型模擬臨床激素依賴性皮炎發生發展過程，動態觀察該疾病的病理變化，為今后治療提供理論基礎及治療思路。

1 材料和方法

1.1 材料：12只成年健康雄性新西蘭大白兔（沈陽寶利恒生物技術有限公司），0.02%丙酸氯倍他索乳膏（廣東華潤順峰藥業有限公司），本實驗通過中國醫科大學倫理委員會審批。

1.2 方法：12只白兔每只背部用動物剃毛器機械剃毛5cm×8cm大小范圍，充分暴露其皮膚，暴露部位皮膚每日1次外涂1/2指尖單位0.02%丙酸氯倍他索乳膏（恩膚霜）連續80d，于兔背毛再次生長后繼續機械剃毛至不再生長。造模開始每5d應用數碼相機拍照，觀察造模皮膚外觀變化。取造模前及造模后第20、35、50、65及80天各時間點的皮膚組織進行病理活檢，活檢組織置于4%甲醛中固定，石蠟包埋，常規切片做蘇木素-伊紅染色（HE）在普通光鏡200倍鏡下觀察表皮厚度變化，天狼猩紅染色在普通光鏡200倍及偏振光鏡400倍鏡下觀察真皮中膠原纖維變化。

1.3 統計學分析：本研究采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用（x?±s）進行描述，方差分析進行比較。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 主觀外觀變化：外用0.02%丙酸氯倍他索乳膏第20天可見造模處皮膚潮紅;第35天皮膚潮紅加重、干燥、可見丘疹及小膿皰，無毛發生長;第50天可見皮膚干燥，片狀紅斑，皮膚干燥附有少量鱗屑;第65天外觀可見片狀紅斑、皮膚明顯變薄、皮下可見毛細血管，表面干燥脫屑，停藥2d皮膚潮紅、干燥較前更加明顯，繼續用藥后可緩解，呈現激素依賴性皮炎癥狀。第80天背部皮膚明顯變薄，皮下毛細血管清晰可見，上附有少許鱗屑，第80天后有4只兔死亡，見圖1。

2.2 皮膚病理變化

2.2.1 表皮：HE染色鏡下觀察表皮厚度變化：第20天表皮較正常比較增厚，差異有統計學意義（P <0.05）;第35天表皮厚度較正常比較增厚，薄厚略有不均，差異有統計學意義（P <0.05）;第50天表皮厚度較正常比較明顯增厚，薄厚明顯不均（P <0.05）;第65天較正常比較表皮厚度下降、與第50天比較下降明顯，薄厚不均程度較前減輕，差異有統計學意義（P <0.05）;第80天表皮厚度較正常比較下降，差異有統計學意義（P <0.05）;但與第65天比較無明顯差異，表皮厚度趨于均勻，結果見圖2～3。

2.2.2 真皮：天狼猩紅染色普通顯微鏡200倍鏡下顯示，正常真皮中的膠原纖維含量較多，偏振光鏡400倍鏡下顯示真皮內Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維較粗、排列規則、致密;第20天普通光鏡下真皮中膠原含量較正常皮膚無明顯差異，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維較正常皮膚變得略纖細、排列稍紊亂;第35天普通光鏡下真皮中膠原纖維含量較正常減少，差異有統計學意義，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維變纖細、排列松散、扭曲;第50天普通光鏡下真皮中膠原纖維含量較正常明顯減少，差異顯著，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維變得更加纖細、凌亂;第65天普通光鏡下真皮中膠原纖維較正常明顯減少，差異顯著，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維纖細、排列紊亂，出現斷裂;第80天普通光鏡下真皮中膠原纖維含量較正常明顯減少，差異顯著，但與第65d比較無差異，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維更加纖細、排列紊亂、扭曲、斷裂，見圖4～5。通過統計分析真皮內膠原纖維含量隨外用激素時間延長而逐漸減少，見圖6。主觀外觀及客觀病理變化均證實激素依賴性皮炎造模成功。

3 討論

目前人們生活水平的提高，對面部美容要求日益提高，從而出現越來越多應用護膚品引起面部皮炎的案例，國內把長期應用含激素或含有激素的護膚品引起的皮炎暫稱為激素依賴性皮炎，雖然目前國際尚無統一命名，但臨床表現公認為皮膚干燥、脫屑、瘙癢、對外界刺激敏感，片狀紅斑和皮膚萎縮等癥狀[2]。該病發病機制也尚未明確，目前主要認可的發病機制考慮為皮膚屏障功能損傷[3]。

國外學者Ludger Kolbe等[4]曾用非入侵的方法研究論證激素依賴性皮炎皮膚變化主要為皮膚萎縮而引起屏障功能損傷，屏障功能受損會增加皮膚的滲透性，進而增加藥物的吸收，引起炎癥因子增加和微生物侵襲破壞皮膚功能。國外學者Schilling等[5]也得出與上述相同推論，他們通過臨床治療并觀察玫瑰痤瘡患者發現皮膚屏障的損傷可加重毛細血管的擴張，引起炎癥因子增加，造成惡性循環。

因倫理原因，不能人體實驗取材觀察，為了驗證激素依賴性皮炎發病過程和可能的機制，本實驗以新西蘭白兔為動物模型，和以往學者應用香豬、豚鼠、小鼠等動物制作該疾病模型[6]比較更經濟實用，易實驗操作，是更為適合造模的實驗對象。

既往制作激素依賴性皮炎動物模型外涂藥物多選用酊劑，因其內不含有基質成分[7]，減少基質對皮膚非特異性增生影響，從而縮短造模時間。而臨床中激素依賴性皮炎患者的病因多是因為應用了含有基質的激素類乳膏或護膚品導致，所以應用含激素的酊劑外涂造模并不能有效的反映臨床激素依賴性皮炎的實際病理變化，因此本實驗應用丙酸氯倍他索乳膏為造模藥物。丙酸氯倍他索乳膏為成品膏劑，內含有一些基質成分，乳膏中基質成分一般含硬脂酸、液狀石蠟、羊毛脂、白凡士林、三乙醇胺等[8]。該乳膏制作動物模型雖然較外涂酊劑時間長，但更能有效模擬臨床激素依賴性皮炎的實際病理形成過程及可能的發病機制。

外用0.02%丙酸氯倍他索乳膏第20天可見造模處皮膚潮紅;第35天皮膚潮紅加重、干燥、可見丘疹及小膿皰，外觀無毛發生長;第50天可見皮膚干燥，片狀紅斑，皮膚干燥附有少量鱗屑;第65天外觀可見片狀紅斑、皮膚明顯變薄、皮下可見毛細血管，表面干燥脫屑，停藥2d皮膚潮紅、干燥較前更加明顯，繼續用藥后可緩解，呈現激素依賴性皮炎癥狀。研究表明激素依賴性皮炎，表皮變化并不一定是持續變薄，可能由于基質的因素會存在過敏、非特異性炎性增生期，但隨時間的延長，表皮開始逐漸變薄，所以表皮變薄是激素依賴性皮炎一特征性病理變化[9]。正常真皮中的Ⅰ型膠原為主要成分，約占80%以上，其次為Ⅲ型膠原纖維比例約占10%～15%，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維為真皮中基質的主要成分[ 1 0 ]。造模第20天至第50天模型出現表皮非特異性增生的過程，在第50天表皮厚度達高峰，但第50天真皮中膠原纖維較正常狀況下卻明顯減少;第65天表皮厚度較正常下降，較第50天厚度明顯降低，真皮中膠原纖維也繼續明顯減少，真皮中Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維隨激素應用時間的延長而逐漸變得纖細、扭曲、甚至斷裂。這些實驗結果均與前面的研究相一致，所以進一步證實激素依賴性皮炎病理表現主要為表皮的變薄，真皮膠原纖維的減少、破壞而導致皮膚屏障功能損傷。因造模第80天與第65天表皮及真皮差異均不明顯，且有4只兔外涂激素到80d，出現感染癥狀，最終死亡，考慮可能涂抹面積相對較大，隨時間延長導致機體吸收激素過多，引起機體不良反應而死亡，所以結合造模第65天模型的外觀和病理特點造模已成功。

以上研究結果給今后用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依賴性皮炎動物模型推薦了造模時間及外觀表現的數據，能成功模擬臨床激素依賴性皮炎疾病的病理變化及發展過程，為進一步臨床診治，如觀察藥物治療、激光和強脈沖光治療[11-12]等提供研究模型。