溫度對(duì)四川華鳊胚胎發(fā)育的影響

王亞利，解崇友，尹 敏，蔡瑞鈺，王志堅(jiān)

( 西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715 )

四川華鳊(Sinibramataeniatus)，屬鯉形目、鯉科、鲌亞科、華鳊屬，俗稱墨線魚，雜食性，僅分布于岷江、大渡河和嘉陵江等水域，是長江上游特有魚類，有較大社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。近年來受岷江、嘉陵江等流域攔河筑壩、過度捕撈的影響，四川華鳊適宜生境減少，并出現(xiàn)了小型化趨勢(shì)，資源量不斷下降[3-4]。目前有關(guān)四川華鳊的研究主要集中在其分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、線粒體基因組繁殖生物學(xué)[3-7]等工作，暫無胚胎發(fā)育相關(guān)研究。要對(duì)四川華鳊胚胎方面展開研究，其人工繁殖技術(shù)必然要取得突破。四川華鳊成熟親魚在室內(nèi)養(yǎng)殖馴養(yǎng)已取得初步成功，其抗病性強(qiáng)，溫度耐受范圍廣，易于養(yǎng)殖，因此其人工繁殖得以攻克。魚類的胚胎發(fā)育是個(gè)復(fù)雜的過程，受溫度、溶解氧、pH、鹽度、光照度等[8-11]因素的影響。溫度是魚類胚胎發(fā)育的重要影響因子之一，不同魚類孵化需要不同的溫度，適溫范圍也會(huì)不同[12]。確定魚類胚胎發(fā)育的適宜溫度范圍，是人工繁育所必須掌握的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，眾多學(xué)者就溫度對(duì)不同魚類的胚胎發(fā)育影響進(jìn)行了大量研究，主要為高海拔魚類[13-14]，為水產(chǎn)苗種繁育以及資源增殖提供了重要的參考依據(jù)。人工增殖放流作為種質(zhì)資源保護(hù)的有效手段[15]，可實(shí)現(xiàn)四川華鳊資源量的恢復(fù)。通過觀察四川華鳊胚胎發(fā)育過程，評(píng)估不同孵化溫度條件對(duì)受精率、胚胎發(fā)育速率、畸形率和孵化率等生物學(xué)指標(biāo)的影響情況，以期明確四川華鳊孵化的適宜溫度范圍，并為今后四川華鳊的研究及資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 親魚來源

四川華鳊于2017年5月在岷江水域采集，此后馴養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室4.0 m×0.55 m×0.4 m的循環(huán)水池中。

1.2 人工催產(chǎn)及胚胎孵化

2018年7月中旬，挑選性腺發(fā)育良好、體質(zhì)健壯、無病傷的成熟親魚，雌魚體質(zhì)量為15～25 g，雄魚體質(zhì)量為7～13 g，按雌雄3∶1的比例進(jìn)行人工催產(chǎn)，效應(yīng)時(shí)間結(jié)束后采用干法授精獲得受精卵。受精卵置于18個(gè)直徑14.5 cm、高2.8 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，分為6個(gè)溫度組(16、19、22、25、28、31 ℃)，每組設(shè)置3個(gè)平行，放入相應(yīng)水溫的45 cm×25 cm×25 cm玻璃缸中孵化，水溫變化均控制在±0.5 ℃內(nèi)。每個(gè)培養(yǎng)皿中胚胎數(shù)量約200個(gè)。

1.3 胚胎觀察

胚胎發(fā)育過程用體視顯微鏡(尼康SMZ25)進(jìn)行觀察和拍照，記錄各發(fā)育階段的形態(tài)特征及發(fā)育時(shí)間，以50%胚胎出現(xiàn)新特征作為劃分發(fā)育時(shí)期的依據(jù)。四川華鳊胚胎發(fā)育過程主要參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行分期。25 ℃組的胚胎自受精后的整個(gè)發(fā)育過程采取連續(xù)觀察，其余5個(gè)溫度組整個(gè)過程則每隔30 min觀察一次，每次觀察時(shí)間均不超過3 min，整個(gè)觀察過程控制溫度變化不超過0.5 ℃及觀察行為不影響胚胎的正常發(fā)育。

1.4 不同溫度胚胎發(fā)育

統(tǒng)計(jì)不同溫度下胚胎從一個(gè)時(shí)期發(fā)育到下一時(shí)期所用時(shí)間及每個(gè)時(shí)期胚胎的死亡數(shù)量，并及時(shí)剔除死卵，以免污染水體和影響胚胎發(fā)育，記錄各試驗(yàn)組的受精率(原腸胚期后統(tǒng)計(jì)受精率)、孵化率、畸形率、孵化歷時(shí)，計(jì)算胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度、有效積溫。

受精率%=n1/n2×100%

孵化率%=n3/n1×100%

畸形率%=n4/n3×100%

成活率%=n5/n6×100%

生物學(xué)零度：

有效積溫：K=t×(T-C)

式中，n1為受精卵數(shù)，n2為卵子總數(shù)，n3為孵出仔魚數(shù)，n4為畸形仔魚數(shù)，n5成活仔魚數(shù)，n6為出膜仔魚數(shù)，C為胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度(℃)，n為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度梯度的個(gè)數(shù)，T表示胚胎發(fā)育的水溫(℃)，t表示胚胎完成發(fā)育所需要的時(shí)間，V為胚胎發(fā)育所需時(shí)間的倒數(shù)(1/t)，K表示胚胎發(fā)育的有效積溫(℃·h)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理與分析在Excel 2013和SPSS 22.0中進(jìn)行，顯著性水平為0.05，描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎發(fā)育過程(25 ℃條件下)

在水溫(25±0.5) ℃時(shí)，四川華鳊的胚胎發(fā)育根據(jù)其外部形態(tài)特征可分為受精卵、胚盤形成、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官分化和出膜期8個(gè)連續(xù)發(fā)育階段(圖1)，各發(fā)育階段的形態(tài)描述見表1，整個(gè)胚胎發(fā)育歷時(shí)44.83 h。

2.1.1 受精卵

成熟卵為圓球形、淡黃色，卵徑為(1.34±0.01) mm，具黏性(圖1a)。受精后，受精卵吸水膨脹，呈透明狀，卵徑1.50～1.68 mm，卵質(zhì)分布均勻，極性不明顯(圖1b)。

2.1.2 胚盤形成階段

受精0.67 h后，原生質(zhì)集中于動(dòng)物極，動(dòng)物極中央漸漸凸起形成一圓盤狀隆起，胚盤形成(圖1c)。

2.1.3 卵裂階段

受精0.82 h后，胚盤中央出現(xiàn)分裂溝，細(xì)胞一分為二，此時(shí)為2細(xì)胞時(shí)期(圖1d)；隨后進(jìn)行第2～6次卵裂(圖1e～i)，細(xì)胞呈幾何級(jí)數(shù)增加，隨著分裂次數(shù)增加，分裂球越來越小，形成多細(xì)胞胚體，進(jìn)入多細(xì)胞期(圖1j)。

2.1.4 囊胚期

受精2.85 h后，分裂球很小，細(xì)胞間隙模糊，各分裂球高高堆疊在卵黃上，形成囊胚，囊胚高為0.31 mm、橫徑為0.63 mm，此時(shí)為囊胚早期(圖1k)；受精3.70 h后，囊胚的高度不斷下降，囊胚層變薄，與卵黃囊界限模糊，此時(shí)為囊胚中期(圖1l)；受精5.27 h后，囊胚表面細(xì)胞向卵黃部分下包，約占整個(gè)胚胎的1/3，此時(shí)為囊胚晚期(圖1m)。

2.1.5 原腸胚期

受精6.65 h后，胚盤繼續(xù)下包至1/2，胚層外周形成環(huán)狀增厚細(xì)胞帶，形成胚環(huán)，此時(shí)為原腸胚早期(圖1n)；受精7.37 h后，胚環(huán)下包至2/3，胚盾出現(xiàn)，此時(shí)為原腸胚中期(圖1o)；受精后7.77 h，胚盤下包約3/4，胚胎植物極有一大卵黃栓外露，胚盾增厚，背唇明顯，此時(shí)為原腸胚晚期(圖1p)。

2.1.6 神經(jīng)胚期

受精后8.43 h，胚盤下包約4/5，胚環(huán)變小，僅露出植物極端在外形成原口，未包入的卵黃稱為卵黃栓，胚胎背面中線的細(xì)胞增厚形成神經(jīng)板，腦部漸膨大，胚胎進(jìn)入神經(jīng)胚期(圖1q)；受精后9.07 h，隨著胚層進(jìn)一步下包，卵黃變成不規(guī)則圓形，外露漸小，最后卵黃栓消失，在卵黃栓末端形成圓形有凹陷的胚孔，受精后10.12 h，胚孔封閉，此時(shí)為胚孔封閉期(圖1r)。

2.1.7 器官分化階段

受精后10.82 h，在胚體的中部出現(xiàn)2對(duì)體節(jié)，此時(shí)為體節(jié)出現(xiàn)期(圖1s)；受精后11.42 h，在頭部中央兩側(cè)，有一對(duì)腎形的突起，即眼的原基，體節(jié)為4～6對(duì)，此時(shí)為眼原基出現(xiàn)期(圖1t)；受精后12.45 h，此時(shí)卵黃囊近圓形，隨著頭尾的延伸，胚體的頭尾更接近，頭尾約環(huán)抱卵黃周長的5/6，眼囊清晰，呈長橢圓形，體節(jié)為10～12對(duì)，為眼囊期(圖1u)；受精后13.47 h，胚體出現(xiàn)似橢圓形耳囊，此時(shí)體節(jié)14～15對(duì)(圖1v)；受精后15.08 h，卵黃囊呈腎形，尾芽出現(xiàn)在胚體后端腹面，漸漸與卵黃囊游離，眼囊變圓，此時(shí)為尾芽期，具尾泡(圖1w)；受精后16.95 h，在眼杯口出現(xiàn)橢圓形的晶體，可見胚體開始微弱的間歇性顫動(dòng)，此時(shí)為晶體出現(xiàn)期(圖1x)；受精后17.60 h，尾部已離開卵黃囊，出現(xiàn)尾鰭，肌肉收縮擺動(dòng)幅度變大，為肌肉效應(yīng)期；受精后18.52 h，眼囊圓形，晶狀體非常清晰但無色素沉積，在頭部下方形成半透明圍心腔，細(xì)胞排列成串，胚胎出現(xiàn)血液循環(huán)，此時(shí)為心臟出現(xiàn)期(圖1y)，可明顯觀察到頭后部膨大神經(jīng)管，橢圓狀耳囊已前移，位于心臟的斜后方，胚體擺動(dòng)加劇，收縮頻率為69次/min；受精26.65 h后，可見胸鰭原基(圖1z)，呈半圓弧形，卵黃囊體積縮小，尾部游離變長，約占胚體的1/4。受精后28.42 h，嗅窩形成(圖1aa)，耳囊前移至眼后方，肌節(jié)明顯增多，由于胚體在卵膜中劇烈擺動(dòng)，卵黃囊后端明顯可見具3～4道褶皺；受精后32.32 h，血液為淡紅色；受精后34.15 h，尾略向背方舉起，胚體在卵膜內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，尾部和頭部不停地頂撞卵膜，頭部呈90°彎向腹部，卵黃囊體積進(jìn)一步縮小，前部為一球形，后部延長呈棒狀，尾部游離部分約占胚體的1/3；受精后39.23 h，有血液流經(jīng)一螺旋狀結(jié)構(gòu)，為鰓弧。

2.1.8 出膜期

受精后41.40 h，開始出膜，44.83 h后半數(shù)胚體出膜，受精后49.55 h，基本均已出膜。剛出膜的仔魚無色透明，全長為(4.54±0.04) mm，肌節(jié)36～37對(duì)，血液紅色，心臟位于到卵黃囊前方，鰓弧明顯，可見血液流經(jīng)此處，大部分眼囊無黑色素沉積，耳囊前移至眼后方，胸鰭褶扁鏟狀，未游離，胸鰭下方出現(xiàn)雛形鰾，腹鰭褶與臀鰭褶之間有一明顯分界線，為肛凹，一消化管從頭部連通至肛凹處，尾呈圓形。卵黃囊較大，呈現(xiàn)前粗后細(xì)的棒狀，其側(cè)面有血管的分布，為仔魚輸送營養(yǎng)(圖1bb)。

表1 四川華鳊胚胎發(fā)育時(shí)期及主要特征(25±0.5) ℃Tab.1 Time sequence and characteristics of embryonic development stage in Sinibrama taeniatus (25±0.5) ℃

(續(xù)表1)

發(fā)育時(shí)期Developmental stage 受精后時(shí)間/hTime after fertilization主要特征Developmental characteristics圖序Figure sequence眼囊期Optic vesicle stage12.45頭尾約環(huán)抱卵黃周長的5/6,眼囊清晰,呈長橢圓形,體節(jié)為10～12對(duì)1u耳囊出現(xiàn)期Appearance of ear vesicle13.47胚體出現(xiàn)似橢圓形耳囊,體節(jié)14～15對(duì)1v尾芽期Tail bud stage15.08尾芽出現(xiàn)在胚體后端腹面,漸漸與卵黃囊游離,形成尾芽,肌節(jié)22對(duì)1w晶體出現(xiàn)期Appearance of eye len16.95胚體繼續(xù)延長,尾部與卵黃囊游離的部分繼續(xù)伸長,在眼杯口出現(xiàn)圓形的晶體1x肌肉效應(yīng)期Muscular effect stage17.60晶體清晰,尾部已離開卵黃囊,出現(xiàn)尾鰭,脊索明顯,肌肉收縮擺動(dòng)幅度變大—心臟出現(xiàn)期Appearance of rudimental heart18.52卵黃囊前上方,細(xì)胞排列成串,即心臟原基,跳動(dòng)節(jié)律較慢,血液無色1y胸鰭原基出現(xiàn)Rudimental pectral fin stage26.65可見胸鰭原基,胸鰭原基后下方有一長條錐形的鰾原基,古維爾氏管與胚體呈90°分布于卵黃囊前部,血液為淡黃色1z嗅窩形成Olfactory nest stage28.42嗅窩形成,耳囊前移至眼后方,肌節(jié)明顯增多1aa鰓弧Branchial arc stage39.23胸鰭原基呈扁鏟狀伸向后側(cè),長錐形的鰾原基變大,此時(shí)有血液流經(jīng)一螺旋狀結(jié)構(gòu),為鰓弧—初孵仔魚Newly hatched larva44.83無色透明,全長為(4.54±0.04) mm,肌節(jié)36～37對(duì),可見鰾雛形,腹鰭褶與臀鰭褶之間有一明顯分界線,為肛凹,消化管從頭部連通至肛凹處1bb

注：表中的“—”代表胚體在卵膜內(nèi)擺動(dòng)劇烈，肉眼可見其特征，無法拍照記錄.

Note: the “—” in the table shows that the embryo oscillates so violently in the egg membrane that its characteristics are not to be photographed even visible by the naked eyes.

2.2 不同溫度對(duì)四川華鳊胚胎發(fā)育影響

2.2.1 不同溫度下胚胎的受精率、孵化率、畸形率及成活率

計(jì)算得到不同溫度下胚胎的受精率、孵化率、畸形率及成活率(表2)。隨著溫度的升高，四川華鳊胚胎的受精率和孵化率呈先升后降的趨勢(shì)。16 ℃下，四川華鳊的胚胎在原腸階段全部死亡，其余各溫度組胚胎的受精率均較高。由此可見，溫度過低，卵子無法完成受精。31 ℃組四川華鳊胚胎的受精率顯著低于19、22、25、28 ℃組(P<0.05)，表明溫度較高，受精率會(huì)降低。19 ℃下受精率為97.17%，其孵化率僅30.00%；31 ℃受精率為94.17%，其孵化率為79.11%；25 ℃下孵化率達(dá)到最大，為96.13%。說明了溫度對(duì)四川華鳊胚胎孵化率的影響很大。

19 ℃下出膜的仔魚畸形率較高，達(dá)87.19%，表現(xiàn)為仔魚魚體彎曲，出膜后陸續(xù)死亡，成活率僅9.14%；22、25、28 ℃組胚胎畸形率較低，組間無顯著性差異(P>0.05)，25 ℃的仔魚成活率最高，達(dá)99.13%；31 ℃下胚胎畸形率明顯高于22、25、28 ℃(P<0.05)，約為28 ℃下胚胎畸形率的2倍，其成活率顯著低于22、25、28 ℃組的仔魚成活率(P<0.05)。可見，溫度對(duì)胚胎致畸形影響作用大，溫度過低或過高，均會(huì)導(dǎo)致畸形率升高，成活率降低。

2.2.2 不同溫度對(duì)胚胎發(fā)育速度的影響

溫度對(duì)四川華鳊胚胎發(fā)育速度影響的結(jié)果見表3，結(jié)果顯示：

(1)16 ℃下胚胎發(fā)育到原腸階段全部死亡，在19～31 ℃內(nèi)，隨著溫度上升，整個(gè)胚胎發(fā)育各階段及總孵化歷時(shí)逐漸縮短，各溫度組下胚胎孵化過程總歷時(shí)均差異顯著(P<0.05)，31 ℃下胚胎發(fā)育速度最快，孵化歷時(shí)30.62 h，比19 ℃溫度組縮短了46.31 h，22 ℃溫度組耗時(shí)是31 ℃溫度組的2.07倍。

(2)胚胎的器官分化階段用時(shí)最長，占整個(gè)胚胎孵化歷時(shí)72.53%～77.07%，且各溫度組的器官分化階段歷時(shí)均有顯著差異(P<0.05)。囊胚階段是耗時(shí)第二長的階段，所需時(shí)間大約是器官分化的11%(10.74%～11.57%)，且各溫度組的囊胚階段歷時(shí)也均有顯著差異(P<0.05)。

(3)其他幾個(gè)階段耗時(shí)都比較少，加起來不超過胚胎發(fā)育總時(shí)間的20%。

(4)四川華鳊的整個(gè)胚胎發(fā)育過程表明，溫度對(duì)胚胎發(fā)育所經(jīng)歷的時(shí)間有顯著影響，基本呈現(xiàn)發(fā)育時(shí)長與溫度呈負(fù)相關(guān)。通過胚胎的發(fā)育速率(x)與孵化溫度(y)的分析(圖1)，得出線性關(guān)系y=550.76x+12.69(r2=0.9807，P<0.05)，可知四川華鳊的生物學(xué)零度為12.69 ℃。

圖1 四川華鳊胚胎發(fā)育Fig.1 Embryonic development of Sinibrama taeniatus a.成熟卵； b.受精卵； c.胚盤隆起； d.2細(xì)胞期； e.4細(xì)胞期； f.8細(xì)胞期； g.16細(xì)胞期； h.32細(xì)胞期； i.64細(xì)胞期； j.多細(xì)胞期； k.囊胚早期； l.囊胚中期； m.囊胚晚期； n.原腸胚早期； o.原腸胚中期； p.原腸胚晚期； q.神經(jīng)胚期； r.胚孔封閉期； s.體節(jié)出現(xiàn)期； t.眼基出現(xiàn)期； u.眼囊期； v.耳囊出現(xiàn)期； w.尾芽期； x.晶體出現(xiàn)期； y.心臟出現(xiàn)期； z.胸鰭原基出現(xiàn)； aa.嗅窩形成； bb.初孵仔魚. a.mature egg; b.fertilized egg; c.germinal disc; d.2-cell stage; e.4-cell stage; f.8-cell stage; g.16-cell stage; h.32-cell stage; i.64-cell stage; j.morula stage; k.early blastula stage; l.middle blastula stage; m.late blastula stage; n.early gastrula stage; o.mid-gastrula stage; p.late gastrula stage; q. neurula stage; r.blastopore closed stage; s.segmentation stage; t.optic rudiment stage; u.optic vesicle stage; v. appearance of ear vesicle; w.tail bud stage; x.appearance of eye len; y.appearance of rudimental heart; z.rudimental pectral fin stage; aa.olfactory nest stage; bb.newly hatched larva.

表2溫度對(duì)胚胎的受精率、孵化率、畸形率及成活率的影響%

Tab.2 The effect of temperature on the fertility, hatching, abnormality andsurvival rates of fertilized egg of Sinibrama taeniatus embryos

注：數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，相同列上帶上不同的上標(biāo)的數(shù)值間有差異顯著(P<0.05),下同.

Note: the data are expressed as average mean±standard deviation, and the means with different superscripts in the same line are significantly different (P<0.05),et sequentia.

表3 不同溫度下四川華鳊的胚胎各階段發(fā)育歷時(shí)、有效積溫值Tab.3 Development time and effective accumulative temperature of Sinibrama taeniatus embryos at various stages

圖2 發(fā)育速率與溫度的關(guān)系Fig.2 The relationship between development rate and temperature

3 討 論

3.1 四川華鳊胚胎發(fā)育特征

四川華鳊卵具黏性，卵裂類型為盤狀分裂。根據(jù)四川華鳊胚胎發(fā)育過程的形態(tài)特征并結(jié)合已有的分期標(biāo)準(zhǔn)，將胚胎發(fā)育過程分為8個(gè)連續(xù)發(fā)育階段28個(gè)時(shí)期。大多數(shù)魚類[17-20]的胚胎發(fā)育在器官分化階段之前發(fā)育時(shí)序相同，而在器官分化階段之后各特征的出現(xiàn)順序及發(fā)育程度有所不同。如四川華鳊的肌節(jié)出現(xiàn)于眼囊期之前，而齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[21]肌節(jié)出現(xiàn)于眼囊期之后；四川華鳊尾芽出現(xiàn)于耳囊之后，草金魚(Carassiusauratus)[22]尾芽出現(xiàn)在耳囊形成之前；四川華鳊胚胎在晶體出現(xiàn)期時(shí)其尾部已經(jīng)游離，短須裂腹魚(S.wangchiachii)[17]則在晶體出現(xiàn)期之前尾部開始游離，中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[19]和翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)[23]在晶體出現(xiàn)后的心臟出現(xiàn)期尾部才開始游離。出膜時(shí)四川華鳊尾部約占全長的1/3，翹嘴鲌(Culteralburnus)[24]和短須裂腹魚[17]尾部約占全長比小于1/3。這些器官形成的差異可能跟物種本身遺傳因素有關(guān)，同時(shí)，也可能是生存環(huán)境的作用，使魚類在胚胎發(fā)育過程獲得更適應(yīng)環(huán)境的生理?xiàng)l件。

3.2 溫度、卵徑大小與胚胎孵化歷時(shí)的關(guān)系

水溫在19～31 ℃內(nèi)，四川華鳊胚胎孵化歷時(shí)為30.62～76.93 h。結(jié)果顯示，隨著溫度升高，胚胎發(fā)育速度加快，胚胎孵化歷時(shí)逐漸縮短，與對(duì)斑鱖(Sinipercascherzeri)[25]、斑馬魚(Daniorerio)[26]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[27]等的研究結(jié)果一致。由此可見，胚胎在適宜溫度范圍內(nèi)，孵化歷時(shí)與水溫呈正相關(guān)。因此，在生產(chǎn)上可通過調(diào)控溫度來調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育進(jìn)程。

3.3 溫度對(duì)胚胎發(fā)育的影響

魚類胚胎發(fā)育過程對(duì)水溫條件比較敏感，高溫或者低溫環(huán)境下，都會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形或者滯育，甚至胚胎死亡[29]。因此，魚類胚胎發(fā)育的適宜環(huán)境溫度的探索，是研究魚類繁育的關(guān)鍵。

然而，生物的發(fā)育一般開始于某一個(gè)溫度值，低于這個(gè)溫度時(shí)生物并不會(huì)開始發(fā)育，這個(gè)溫度值就是生物學(xué)零度[35]。四川華鳊胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度為12.69 ℃，水溫在16 ℃時(shí)，胚胎發(fā)育至原腸胚階段全部死亡；玫瑰無須鲃(Puntiusconchonius)[36]的生物學(xué)零度為12.35 ℃，其胚胎在16 ℃ 下發(fā)育至神經(jīng)胚期全部死亡；似刺鳊(Paracanthobramaguichenoti)[37]的生物學(xué)零度為9.50 ℃，在10 ℃下胚胎卵裂異常死亡。可知，當(dāng)水溫與生物學(xué)零度接近時(shí)，胚胎發(fā)育不正常或者無法完成受精過程，最終死亡。

19 ℃時(shí)四川華鳊胚胎的孵化率為30.00%，其畸形率高達(dá)87.19%，所有胚胎出膜后能存活的仔魚9.14%，與鱖魚(S.chuatsi)[38]的研究結(jié)果相似。低溫脅迫可引起細(xì)胞凋亡和肌肉發(fā)育的阻滯，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)育畸形[39]。19 ℃下四川華鳊胚胎發(fā)育速度緩慢，胚胎孵化歷時(shí)較長，可能是低溫降低了胚胎發(fā)育過程中孵化酶的活性，繼而抑制了相關(guān)代謝活動(dòng)，影響胚胎發(fā)育的速度[40]。當(dāng)溫度升至31 ℃時(shí)，胚胎發(fā)育速率更快，但其受精率、孵化率、成活率降低，畸形率明顯升高，原因可能是胚胎孵化環(huán)境的溫度過高，孵化酶以及細(xì)胞膜上相關(guān)酶失活，受精卵細(xì)胞膜的滲透性使得卵裂過程或器官分化過程出現(xiàn)紊亂[41]，導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)畸形概率增加，甚至造成死亡。31 ℃下四川華鳊的胚胎成活率較高，而斑鱖[25]在30 ℃下胚胎發(fā)育至原腸中期全部死亡，33 ℃對(duì)淇河鯽[42]胚胎是致命的，說明不同種魚的胚胎發(fā)育臨界溫度不同，顯然四川華鳊的胚胎發(fā)育的上限高于31 ℃，可以設(shè)置更高的溫度梯度，獲得四川華鳊的胚胎發(fā)育臨界溫度的上限。

本研究結(jié)果顯示，水溫在22～28 ℃時(shí)，四川華鳊的受精率、孵化率、成活率均較高，畸形率較低，為四川華鳊胚胎發(fā)育的適宜溫度，有效積溫為522.35～595.11 ℃·h。然而，綜合受精率、畸形率、成活率等所有因素，在生產(chǎn)上建議四川華鳊的孵化溫度控制在約25 ℃為最佳。