不同產前診斷指征的羊水細胞染色體核型分析

陳競茜 揭秋玲 龍平 鐘高布 孫超 盧惠 王櫻瑾王軍 馬燕琳，4

1海南醫學院第一附屬醫院海南省人類生殖與遺傳重點實驗室（海南醫學院第一附屬醫院生殖醫學科/海南省地方病（地中海貧血）臨床醫學研究中心/海口市人類遺傳資源保藏重點實驗室）（海口570102）；2南方醫科大學南方醫院婦產科（廣州510515）；3德克薩斯州心臟研究中心（休斯頓德克薩斯州77030）；4海南醫學院熱帶轉化醫學教育部重點實驗室（海口571199）；

染色體病是常見的遺傳病，占新生兒疾病的0.7%［1］，2006年全球出生缺陷報告顯示，染色體病主要以21 三體綜合征、18 三體綜合征、13 三體綜合征為主，占出生缺陷的6.9%［2］。2017年一項基于人群的出生缺陷研究發現，遺傳因素包括染色體異常所致的出生缺陷約19.07%［3］。目前該病尚無有效的治療方法，只能是對高危人群進行產前診斷來檢測該類疾病，預防該類患兒的出生。產前診斷包括有創性產前診斷及無創性產前診斷，由于技術及準確性等多方面考慮，目前較常用的產前診斷為羊膜腔穿刺術，目前其產前診斷的指征主要有：胎兒染色體非整倍體無創產前基因檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）高風險，B 超胎兒多發畸形，血清學篩查（唐氏篩查）高風險，父母染色體異常，高齡，不良孕產史和地貧攜帶［4-6］。為提高我國的出生人口素質，臨床上主要用經典的篩查方法：血清學篩查來評估染色體病的發生風險率，陽性病例進一步行產前診斷。隨著產前檢查技術的飛速發展，近年通過NIPT 進行唐氏篩查得到了廣泛應用［7］。隨著超聲醫學的飛速發展，胎兒的超聲軟指標的篩查也應用于產前診斷中。另外隨著我國二孩政策的實施，許多高齡孕婦增加，因年齡因素的胎兒患染色體病的概率也明顯增加，因此，高齡妊娠也成為產前診斷的一個重要指征。海南地區是地中海貧血（thalassemia，簡稱地貧）高發區域，夫婦雙方如為地貧攜帶者需行羊膜腔穿刺術取羊水細胞以檢測胎兒的地貧基因型，防止地貧患兒的出生，同時檢測羊水細胞的染色體核型。本文總結了不同產前診斷指征，在我中心行羊水細胞培養的3 251 例孕婦的羊水細胞染色體核型結果，探討胎兒染色體異常核型與產前診斷指征的關系，為產前篩查及診斷提供參考，同時對提高染色體異常的檢出率，對進一步提高產前診斷的效率具有非常重要的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2013年3月至2016年12月，在我中心遺傳咨詢門診進行遺傳咨詢并經羊膜腔穿刺術進行產前診斷的孕婦3 251 例，年齡19 ～45歲，孕周16 ～31周，產前診斷指征包括NIPT高風險、B 超胎兒多發畸形、唐氏血清學篩查高風險、父母染色體異常、高齡、不良孕產史、地貧基因攜帶。

1.2 方法 在告知孕婦本人及家屬行羊膜腔穿刺術及羊水細胞染色體核型分析的風險及產前診斷范圍，孕婦及家屬簽署知情同意書后在B 超引導下，行羊膜腔穿刺術，抽取羊水20 mL，分裝于兩支15 mL 離心管，1 500 r/min，離心5 min 后棄上清，留取約0.5 mL 制成細胞懸液，按照兩線培養原則，分別無菌接種于兩個4.5 mL 羊水培養基的25 cm3培養瓶中，并分別平鋪混勻。置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養7 d，倒置顯微鏡下觀察羊水細胞貼壁生長情況，當羊水細胞貼壁生長旺盛，并且有3 個以上大克隆，或者7 個以上中克隆，細胞呈圓亮時，便進行傳代處理，使細胞重新分布于4 個培養瓶里繼續培養2 ～3 d 后，當傳代細胞融合率達到70%～80%時，進行兩線細胞收獲、制片，常規染色體G 顯帶，用德國蔡司全自動染色體掃描分析系統進行核型分析，計數20 個分裂相，分析3 個核型，異常核型增加計數，分析量，發現嵌合體至少計數100 個分裂相，并收獲第3 瓶細胞再次進行染色體分析；對于染色體結構異常的核型，建議行父母染色體核型分析，診斷標準按照人類細胞遺傳學國際命名（ISCN2013）標準進行。

1.3 統計學方法 運用SPSS 22.0 統計軟件，卡方檢驗分析各產前診斷指征與產前診斷結局的關系，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體異常核型在不同產前診斷指征中的檢出情況 3 251 例產前診斷的羊水標本中共檢出染色體異常核型182 例，染色體異常核型檢出率為5.60%。不同產前診斷指征的染色體異常核型檢出率不相同，NIPT 高風險的羊水細胞染色體異常核型檢出率最高，為83.84%，詳細檢出情況見表1。

表1 不同產前診斷指征的羊水細胞染色體異常核型檢出情況Tab.1 The diagnosis results of abnormal karyotype of different indication of antenatal diagnosis例

2.2 染色體異常核型分布情況 182 例染色體異常核型中常染色體數目異常130 例，性染色體數目異常8 例，平衡性結構異常28 例，非平衡性結構異常4 例，嵌合體10 例，倒位2 例。染色體的多態性如9 號染色體的臂間倒位，D/G 組隨體及短臂多態變異以及縊痕區的多態變化，在本文中不作討論。染色體異常核型詳細分布情況見表2。

表2 羊水細胞染色體異常核型分布情況Tab.2 The distribution of chromosomal abnormal karyotype of antenatal diagnosis（n=182） 例

2.3 不同產前診斷指征染色體異常核型差異情況 染色體異常核型組182 例，染色體正常核型組3 069 例。產前診斷指征中，染色體異常組和染色正常組中NIPT 是否為高風險，B 超胎兒是否多發畸形，唐氏篩查是否高風險，父母染色體是否異常，孕婦是否高齡及是否地貧基因攜帶比較，其染色體異常檢出率差異具有統計學意義（P＜0.05）；而是否具有不良孕產史比較，其染色體異常檢出率差異不具有統計學意義（P=0.581）。見表3。

2.4 NIPT產前篩查優于血清學篩查 NIPT對T21具有較高的準確性，對T18 以及T13 仍存在較大的假陽性率。本文統計了89 例T21，T18，T13 的孕婦無創性NIPT 檢測以及相應的有創性羊水產前診斷結果對比，見表4。

表3 不同產前診斷指征染色體異常核型的差異Tab.3 The difference chromosomal abnormal karyotype in different indication of antenatal diagnosis 例（%）

表4 89 例孕婦無創NIPT 三體高風險與羊水細胞染色體診斷結果Tab.4 89 cases maternal NIPT′s trisomy high risk and antenatal diagnosis results 例

3 討論

3.1 針對性的產前診斷可以提高染色體異常的檢出率 染色體核型異常可導致染色體病，是常見的遺傳性疾病之一，目前仍無有效的治療方法，只能聯合應用多種篩查及診斷方法互相補充診斷染色體病，從而減少該類遺傳性疾病患兒的出生。針對不同產前診斷指征，如NIPT 高風險，B 超胎兒多發畸形，唐氏篩查高風險，父母染色體異常，高齡，不良孕產史等進行產前診斷是可以減少染色體病兒出生。本文回顧性地分析了3 251 例羊水標本，發現染色體異常核型182 例，異常檢出率為5.60%（182/3 251），與近幾年國內其他地區文獻報道的檢出率相似，為5.93%～8.10%［8-9］。各地區報道的染色體核型異常檢出率具有細微差別，可能是由于納入分析的人群中產前診斷比例的不同以及各地區人群染色體異常的特異性所致。有針對性的產前診斷可以有效地診斷染色體病，降低遺傳性疾病缺陷兒的出生，產前診斷指征的嚴格把控，對提高染色體異常檢出率，進一步提高產前診斷的效率具有重要意義。

3.2 NIPT 假陽性率 NIPT 檢測作為一種較新的非介入的較高準確性的產前篩查技術，該技術與傳統的唐氏篩查相比較，NIPT 對T21 有較高的準確性。對于篩查為高危的孕婦，該檢查可以增加染色體陽性檢出率，減少漏檢，可有效地降低穿刺檢查的數量。該技術接近于羊水胎兒染色體核型分析技術，具有高敏感性，高特異性，早期檢測，無創安全，其用時少，風險小，取材簡單，不管是從心理和生理層面均減少了孕婦的痛苦及減少了大量不必要的有創性產前診斷等優勢，較大程度地優化了產前診斷流程，改善了產前診斷服務模式，正被越來越多的孕婦及家屬認可［10-12］。但NIPT 仍具有一定的局限性，該技術條件要求較高，對染色體的數目異常及嵌合體，易位等結構異常仍無法檢測，出現假陽性及假陰性［13-14］，其中T21 假陽性率最低，為0.09%，T18 假陽性率為0.19%；T13 假陽性率最高為0.22%。既往研究中，ZHANG 等［7］納入112 669 例病例分析NIPT 檢測T21 的假陽性率為0.05%，T18 的假陽性率為0.045%，T13 的假陽性率為0.04%。同時GRATI 等［15］納入3 222 例病例分析NIPT 檢測T21 的假陽性率為0.097%。假陽性結果與本研究中T21、T18 與T13 的假陽性率接近。同時NIPT 不適宜檢測多胎妊娠［16］，因此NIPT 仍未能替代傳統的篩查方法及產前診斷。因無國家食品藥品監督總局認證，本實驗室尚無開展基因芯片技術及二代測序技術，只能依靠比較初級的檢測來提高產前診斷異常核型的檢出率。

3.3 不同產前診斷指征中染色體三體異常率最高 本研究發現的染色體異常核型中，以染色體三體異常率最高，為138 例，占所有異常核型75.8%（138/182），其中以21三體為主（95例），其占三體異常的68.8%（95/138），與文獻［5，17］報道基本一致。本研究的7 種產前診斷指征均與胎兒染色體異常密切相關。NIPT 高風險的檢出率最高，為83.84%，99例NIPT高風險中，羊水檢測54例為T21，16 例為T18，3 例為T13，5 例為性染色體異常，3 例為嵌合體，2 例為其他染色體異常。在3 251 例孕婦中，因唐篩高風險而進行羊水產前診斷的有1 866 例，共檢出30 例異常核型，異常率為1.61%，23 例T21，1 例T18，2 例易位染色體核型，4 例嵌合體。由此可見唐篩不僅能檢出T21，T18，也能檢出其他異常的染色體。B 超檢測出的胎兒異常包括羊水過多或過少，腎積水，胎兒頸項透明層增厚，雙側（單側）脈絡叢囊腫，側腦室囊性水腫，胎兒水腫，胎兒心室內強回聲點等各種胎兒畸形均可能與染色體有關［18-20］，B 超篩查是檢測胎兒遺傳病的重要手段。本文研究的B 超胎兒多發畸形的異常核型檢出率為8.96%，其中檢出8 例T18，4 例T21，2 例T13，1 例嵌合體，1 例其他染色體異常，18 三體在中孕時會出現多發畸形的各種結構異常，B 超篩查對18 三體的敏感性較高，現在B 超作為一種無創傷性的產前診斷指征已受到關注。

3.4 高齡孕婦，夫婦染色體異常等更應重視產前診斷 隨著我國計劃生育政策的放寬，欲生二孩的高齡孕婦越來越多。本研究中高齡孕婦的染色體異常檢出率為3.76%，遠遠高于唐篩的異常檢出率1.61%，也遠遠高于新生兒染色體異常率0.7%。母親高齡是形成“三體”病的原因之一。因為隨著年齡的增加，女性的卵原細胞受外界的影響因素越來越多，卵巢功能開始退化，導致配子的易發畸形，胎兒易患染色體異常的概率增加［21］。隨著年齡的增加，染色體數目及結構異常發生率顯著增加，如21-三體，18-三體及13-三體［22-25］。我國的《母嬰保健法實施辦法》也規定，對高齡孕婦直接進行羊膜腔穿刺術的產前診斷。因此，對于高齡孕婦，更應該重視產前診斷，對胎兒染色體進行檢查，及時發現異常，預防染色體病兒的出生。

夫婦染色體異常是僅次于NIPT 異常核型檢出率最高的一組。當在臨床羊水標本中發現結構異常的染色體核型時，為了判斷該異常核型的來源均建議其雙親行外周血染色體核型分析。雖然大部分檢出的異常核型來源于父母的平衡性易位，可以發育至正常分娩，但少數異常胎兒的檢出仍需羊水穿刺來檢查。YU等［26］研究發現具有不良孕產史夫婦的胎兒染色體異常率為7.4%，本研究中異常檢出率為3.28%，均較新生兒染色體異常率0.7%明顯增高。因此，不良孕產史也是羊水產前診斷高危指征之一。

3.5 加強海南地區產前篩查與產前診斷的宣教尤為重要 海南省是我國地貧基因攜帶、患病的流行的區之一。我省對可能生育的地貧兒或已生育地貧兒的家庭給予產前免費檢查，并且對這部分孕婦在進行羊膜腔穿刺術取羊水進行胎兒地貧基因檢測的同時也進行胎兒細胞培養及核型分析。因海南地區偏遠、少數民族較多，這部分患者的產前檢查意識較低，且大部分患者來自鄉鎮，幾乎不做產前篩查。本文研究了421 例因地貧攜帶來行產前診斷的孕婦，同時進行細胞染色體核型分析，減少地貧產前診斷中遺漏染色體異常病例。本研究中共發現10 例異常核型，異常核型率為2.38%，低于整體人群，與韋世錄等［27］的研究結果一致。以上數據提示，在防治地貧的同時，也要減少染色體異常患兒的出生，有針對性的產前診斷可以提高胎兒染色體異常的檢出率，對提高我國人口優生很有社會效益。

綜上所述，結合NIPT 高風險，B 超異常，唐篩高風險，父母染色體異常，高齡等各種產前診斷指征來進行羊水染色體檢查，以確診胎兒染色體核型，并對可能妊娠異常染色體胎兒的夫婦進行遺傳咨詢，可以明顯提高染色體異常的檢出率，減少染色體異常兒的出生率，從優生的角度提高我國出生人口的身體素質具有重大意義。