蜂毒肽基因原核表達載體的構建及重組蛋白生物活性作用的研究

王文佳，田維毅，蔡 琨，王 平，梁建東，何光志

貴州中醫大學基礎醫學院，貴陽 550002

蜂毒是蜜蜂科昆蟲中華蜜蜂(ApisceranaFabricius)等工蜂尾部螫刺毒腺和副腺分泌出的具有芳香氣味的淡黃色透明毒液，屬于祖國醫學中傳統動物藥的一種[1]。臨床廣泛用于風濕性關節炎、腰痛、血栓及腫瘤等疾病治療[2-5]。目前蜂毒的自然生產遠不能滿足用藥需求，并且其常規采集方法是電擊取毒，這種方式對人體呼吸道有強烈的刺激作用，也不利于生態環境。不斷發展的生物工程技術為蜂毒的獲得提供了一條新途徑[6]。蜂毒是含有多種生物學活性的復雜混合物[7]，主要含有蜂毒肽(melittin)、活性酶、生物胺和其它酸類物質等，在臨床使用中可見嚴重過敏反應。蜂毒肽約占蜂毒干重的50%，具有較高的生物活性，有抗炎、鎮痛、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用[8]，不是常規蜂毒過敏診斷分子[9]，有望成為新的抗菌肽藥物。其分子量小，基因序列短，易于合成和轉染，適合作為目的基因，可利用基因工程技術獲得。但蜂毒肽可溶解細胞膜，所以不易直接用細胞表達活性蜂毒肽。利用異源細胞進行蜂毒肽重組蛋白的表達，并從中選擇高效表達系統，是基因工程生產蜂毒肽的關鍵技術之一。筆者團隊通過人工合成蜂毒肽基因，構建蜂毒肽融合蛋白的表達載體，轉入原核細胞中進行誘導表達，改進分離純化技術，提取目的蛋白蜂毒肽，進行體外抑菌試驗及抗腫瘤試驗等生物活性檢測。為蜂毒肽的基因工程生產提供實驗基礎。

1 主要材料與試劑

1.1 主要試劑

粉碎緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，0.1% Triton X-100，5%甘油，1 mM DTT，pH=8.0)；結合緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，5%甘油，pH =8.0)；清洗緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，5%甘油，20 /50 mM咪唑，pH=8.0)；洗脫緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，5%甘油，500 mM咪唑，pH=8.0)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Phamacia公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(江蘇瑞楚生物科技有限公司)；DMEM培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；0.02%EDTA /0.25%胰蛋白酶(北京邁晨科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 試劑盒

SDS-PAGE試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；RNA抽提試劑盒(批號：B012005018，北京百泰克生物技術有限公司)；RT試劑盒(批號：lot#B050002018，北京百泰克生物技術有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(批號：Cat#KT201，北京百泰克生物技術有限公司)；96孔培養板(美國Corning公司)；T25細胞培養瓶(美國Corning公司)。

1.3 載體、菌種及細胞

pGEX6p-1載體，引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成；金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌及大腸埃希菌，由貴州中醫藥大學形態實驗室教研室提供；人乳腺癌MCF-7細胞，購于中國典型培養物保藏中心。

1.4 主要實驗設備

多功能電泳儀(型號：powerpac TM Basic，美國BIO-RAD公司)；低速大容量離心機(型號：TD5A-WS，湖南湘立科學儀器有限公司)；潔凈工作臺(型號：CJ-1D，天津市泰斯特儀器有限公司)；梯度PCR儀(型號：T100 thermal cycle，美國BIO-RAD公司)；高速離心機(型號：Thermo Scientific SORVALL LEGEND MICRO 21R，美國Thermo公司)；凝膠成像儀(型號：Bio-RAD chemiDocTM XRS+，美國Thermo公司)；CO2培養箱(型號：USA3131，美國Thermo公司)；自動酶標儀(型號：1510 型，美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(型號：DSZ2000X型，日本Olympus公司)；全自動高壓滅菌鍋(型號：SX-700，日本TOMY公司)。

2 方法

2.1 表達菌株的構建和蛋白誘導條件的優化

根據Genebank中公布的蜂毒肽基因(melittin)序列(NM001011607)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成基因片段，插入pGEX6p-1載體。取1 μL重組的pGEX6p-1質粒轉化BL21(DE3)，42 ℃熱擊90 s后冰上靜置5 min后，加入700 μL培養基，37 ℃培養45 min，涂平板(100 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃培養過夜。次日，挑取單個菌落(表達BL21(DE3))轉入4 mL LB培養基，加入100 μg/mL氨芐青霉素，37 ℃，220 rpm培養過夜。培養所得菌液，按1∶100比例分別接種于8支試管(4 mL LB培養基，內含100 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃，220 rpm培養。當OD值達到0.6左右時，添加0.2 mM的IPTG，設定的表達溫度時間梯度分別為16 ℃過夜、25 ℃過夜、30 ℃過夜、37 ℃ 5 h后終止表達，陰性對照不加誘導劑IPTG，4 °C，5 000 rpm，離心5 min，用PBS緩沖液收集菌體。所得菌體進行SDS-PAGE檢測，選擇誘導蛋白表達的最佳條件進行下一步實驗。

2.2 pGEX6p-melittin表達純化

培養所得菌液，按1∶100分別轉種于試管(4 mL LB培養基，100 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃，220 rpm培養。當OD值達到0.6左右時，添加0.2 mM的IPTG，25 ℃，220 rpm，培養過夜，4 °C 5 000 rpm離心5 min收集菌體。用Buffer(50 mM Tris，300 mM NaCl，0.1%Triton X-100，5 mM DTT，10%甘油，pH8.0)破碎溶解，超聲碎菌(冰浴，功率500 W，25 min，每超聲2 s，暫停6 s為一個循環)。碎菌后，4 ℃，12 000 rpm，離心20 min，取上清液，親和層析。取GST填料5 mL，用Binding Buffer 10倍柱床體積，流速5 mL/min，清洗平衡柱子。樣品(上清液)上柱，流速2 mL/min，收集穿透液。Binding Buffer 10倍柱床體積，流速10 mL/min，清洗柱子。Elution Buffer洗脫，流速2 mL/min，收集洗脫液。進行SDS-PAGE電泳分析，將10 mM還原性谷胱甘肽洗脫組分別透析到1×PBS，2 mM DTT，pH7.4透析液中，過夜。冷凍重組蛋白液獲得干燥粉5 mg備用。

2.3 SDS-PAGE電泳、蛋白濃度分析

所獲得重組蛋白進行SDS-PAGE電泳。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書分別制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，待膠體凝固后取下膠板安置于垂直電泳槽中，電泳液注滿電泳槽，取重組蛋白10 μL加入樣品孔，以蛋白Marker為參照標準。加90 V電壓至溴酚藍指示劑進入分離膠后，電壓升高至160 V，待指示劑近膠體底部時取出凝膠進行灰度分析，檢測重組蜂毒肽的純度，使用SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒檢測重組蜂毒肽的濃度。

2.4 免疫印跡

取方法2.2純化蛋白經SDS-PAGE后，轉印硝酸纖維素薄膜進行轉膜，采用鼠源抗His-tag抗體(1∶3 000)一抗與兔抗鼠IgG抗體(1∶3 000)二抗(參照說明書使用劑量)進行免疫印跡分析。使用AEC底物顯色試劑(按照試劑盒說明書制備)完全浸潤轉印膜，常溫，10 min，去離子水沖，洗終止反應，觀察記錄結果。

2.5 藥敏試驗

2.5.1 表達蛋白液和菌懸液的制備

將純化重組蛋白液的冷凍干燥粉加無菌蒸餾水稀釋至50 mL(重組蛋白0.5 g/mL，pH7.2)備用。將6 mm圓形濾紙片浸泡于重組蛋白液中，陰性對照浸泡無菌蒸餾水，2 h后40 ℃烘干各待試紙片備用。

黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌及大腸埃希菌分別轉種于普通液體培養基中6 h后，分別轉入普通液體培養基18 h復蘇增菌后，再分別接種于普通營養瓊脂平板，37 ℃，18 h。分別挑取平板所培養菌落，各自放入3 mL生理鹽水(振蕩混勻)，以0.5號麥氏比濁管為標準，制備菌液。

2.5.2 抑菌實驗

用無菌棉簽分別蘸取以上4種菌液均勻涂布于MH藥敏瓊脂平板。將待試紙片貼于平板上，每個平板均勻放置重組蛋白紙片3片，無菌蒸餾水紙片1片作為陰性對照，37 °C，培養20 h，測量紙片周圍抑菌環直徑。上述作3個平行樣，取3次平均值為最終抑菌直徑。

2.6 抗腫瘤實驗

培養4代人乳腺癌MCF-7細胞進行腫瘤抑制實驗，設陰性對照組、不同濃度重組蛋白組、空白組。稱取1 mg重組蛋白用高糖型細胞培養液(DMEM-H)，不加胎牛血清(FBS)，稀釋得到50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L共5個濃度備用。取對數生長期的MCF-7細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗，加入0.02%細胞消化液(EDTA /0.25%胰蛋白酶)1 mL，37 ℃，3 min，鏡下觀察約80% MCF-7細胞變圓時，移液器取DMEM-H (含10% FBS)培養液3 mL反復吹打，收集后離心，再用DMEM-H(含10%FBS)培養液調整為4×104個/mL單細胞懸液。取96 孔板各孔加入100 μL，培養12 h后細胞貼壁長滿底部，加入不同濃度重組蛋白各100 μL，對照組加DMEM-H培養液稀釋(不含FBS)100 μL，空白組無細胞，加DMEM -H培養液，含10% FBS和不含FBS各100 μL，每組設3個平行孔，37 ℃，5%CO2孵化箱培養。分別培養12、24、36、48、72 h后，取出，每孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑鹽(MTT)(PBS配制濃度)20 μL，繼續培養4 h，棄培養液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，上低速搖床10 min，靜置20 min，酶標儀490 nm測各孔吸光度OD值，測定重組蛋白的相對活力。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 重組蛋白的表達及定位

重組蛋白最佳表達條件為：25 ℃溫度，IPTG濃度為0.2 mM。通過SDS-PAGE電泳對重組蛋白進行純度分析，結果在25～35 kDa之間出現明顯的條帶，表明加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后有目的蛋白表達，與預期基因序列表達蛋白分子量與31.9 kDa基本一致(見圖1)。

圖1 表達蛋白SDS-PAGE及表達定位Fig.1 SDS-PAGE and location of expressed protein注：IPTG，0.2 mM；M：Protein Marker；1.PGEX6P-1空載體誘導上清；2.PGEX6P-1空載體誘導上清沉淀；3.16 ℃過夜誘導沉淀；4.16 ℃過夜誘導上清；5.25 ℃過夜誘導沉淀；6.25 ℃過夜誘導上清；7.30 ℃過夜誘導沉淀；8.30 ℃過夜誘導上清；9.37 ℃過夜誘導5 h沉淀；10.37 ℃過夜誘導5 h上清。Note:IPTG,0.2 mM;M:Protein Marker;1.PGEX6P-1supernatant of empty body induction;2.PGEX6P-1 precipitation of supernatant induced by empty body;3.16 ℃overnight induced precipitation;4.16 ℃ overnight induction supernatant;5.25 ℃ overnight induced precipitation;6.25 ℃ overnight induction supernatant;7.30 ℃overnight induced precipitation;8.30 ℃overnight induced precipitation;9.37 ℃precipitation was induced overnight for 5 h;10.37 ℃supernatant was induced overnight for 5 h.

3.2 純化蛋白檢測、灰度分析及免疫印跡

使用GST親和層析對重組蛋白進行收集，通過SDS-PAGE電泳在相應位置(31.9 kDa)出現明顯條帶，表明重組蛋白成功得到了純化(見圖2)。將重組蛋白的SDS-PAGE膠，通過ChemiDocTM XRS+system.，進行灰度分析，其純度為90.4%(見圖3)。通過SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定重組蛋白濃度，測定蛋白時的體積為30 μL，BSA濃度為2 mg/mL，計算得蛋白濃度為0.6 mg/mL(見圖4)。

圖2 重組蛋白純化免疫印跡分析Fig.2 The recombinant protein purification for Western blot analysis注：1.目的蛋白；2.蜂毒肽印跡。Note:1.Target protein; 2.Melittin imprinting.

圖3 重組蛋白灰度分析圖Fig.3 Gray analysis chart of recombinant protein

圖4 重組蛋白定量分析圖Fig.4 Quantitative analysis chart of recombinant protein

3.3 抑菌試驗

重組蛋白對金黃色葡萄球菌有高度敏感性(15.2 mm)，對大腸埃希菌有中度敏感性(12.9 mm)，對銅綠假單胞菌(6.7 mm)和傷寒沙門菌(8.4 mm)有低度敏感性。結果見表1。

表1 重組蛋白對各試驗菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of recombinant protein on experimental bacteria

3.4 抗腫瘤作用

5個濃度重組蛋白50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L作用于MCF-7細胞，在12、24、36、48、72 h對MCF-7細胞生長均有穩定抑制作用，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。結果顯示重組蛋白的濃度越高，作用時間越長，其抑制腫瘤的作用越強。結果見表2、圖5。

表2 重組蛋白對MCF-7細胞的生長影響(相對活力)Table 2 Effect of recombinant protein on the growth of MCF-7 cells(relative vitality)

圖5 重組蛋白對MCF-7細胞的生長影響曲線圖Fig.5 Effect of recombinant protein on growth of MCF-7 cells

4 討論

蜂毒肽是蜂毒主要生物活性成分，也是一種抗菌肽。抗菌肽(antimicrobial peptides)廣義上是指生物防御系統中產生的，廣泛存在于微生物、動物及植物體內[10],具有抵御外界微生物侵害，清除體內突變細胞的一類帶正電荷的兩親性小分子抗菌肽，是生物先天免疫的重要組成成分。研究發現抗菌肽具有廣譜抗菌活性，多數抗菌肽不僅能殺死細菌，而且對真菌、原生動物、病毒以及腫瘤細胞具有細胞毒性[11,12]。具有高效性、抗原性弱、穩定性好等特性。因此，抗菌肽是新一代抗生素的理想替代者，具有極好的市場開發前景[13,14]。目前獲取蜂毒肽的方法主要有化學合成、從粗蜂毒中分離純化和生物工程法3種[15]。其中化學合成獲得蜂毒肽純品的成本太高，不適合蜂毒肽的批量生產。從粗蜂毒中分離純化蜂毒肽純品是目前主要獲得途徑，運用色譜原理進行分離純化，隨著色譜技術的提升以及與其他提取工藝的聯合，操作成本降低，產量和純度有所提高，但原材料主要是通過電擊蜜蜂獲取，這種方式對蜂源有要求，且不利于生態環境。隨著生物工程技術的發展，為蜂毒肽的獲得提供了新途徑。利用基因工程菌表達目的蛋白，然后收集純化表達蛋白，從而得到蜂毒肽純品。

蜂毒肽由26個氨基酸殘基組成，中間區域是疏水性氨基酸殘基，還含有脯氨酸殘基和精氨酸殘基，使其成為一個強堿性肽，分子量為2.84 kDa，基因序列為NH2-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-COOH。其基因序列短，易于合成和轉染，適合作為目的基因。但蜂毒肽是兩親性分子，其中親水氨基酸殘基的分布不均勻且本身分子量小，可與帶負電荷的細胞在膜表面結合，形成孔隙破壞生物膜引起細胞內容物滲漏，并隨著滲透性增強，最終導致細胞裂解[16]。故直接在感受態細胞中表達蜂毒肽對其有毒性，統計發現在宿主細胞中單獨表達的報告并不多且表達量不高[17]。解決此難題是基因工程生產蜂毒肽的關鍵技術之一。從異源表達系統中獲得有活性的蜂毒肽，以融合蛋白的形式表達是解決矛盾的方法之一。融合表達可降低蜂毒肽對宿主細胞的毒性，增加產物的穩定性，切除其承載部分就能得到目的蛋白，也是抗菌肽常用的表達策略。研究采用人工合成melittin基因，并構建pGEX6p-1-melittin載體，轉入BL21(DE3)中進行誘導表達，采用SDS-PAGE電泳純化重組蛋白和灰度分析測定蛋白濃度，結果證明基因工程方法可獲得穩定的蜂毒肽。進一步對所獲得重組蛋白進行抑菌實驗及抗腫瘤實驗等生物活性檢測，同時證明重組的蜂毒肽仍保留原有的生物活性。

科學利用基因工程技術生產蜂毒肽，根據其電荷特性、結構特點構建新型表達載體，實現蜂毒肽融合蛋白在單細胞生物中的穩定表達，即可以規避蜂毒中其它成分如磷酸脂酶A、透明質酸酶所引起的過敏反應[18]，又可以突出蜂毒的抗炎、抗菌、抗病毒、抗輻射及抗腫瘤等多種藥理學作用[19]。本實驗為基因工程生產蜂毒肽提供實驗理論依據。而選擇蜂毒肽高效表達系統，改進分離純化技術，可為蜂毒肽的基因工程批量生產朝著低成本、高表達、更方便的方向發展，同時也為毒性藥物生產提供一種可行性。