護肝益肺方水提物對抗結核藥所致肝損傷小鼠保護作用的研究

丁亮，武謙虎，凌美，盛健惠，張建軍，彭國平，李存玉，黃春帆

作者單位：1南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2鎮江市第三人民醫院藥劑科，江蘇 鎮江 212000

藥物性肝損傷（Drug-Induced Liver Injury，DILI）是指因藥物或其代謝產物的毒性作用、或機體對藥物產生過敏反應而對肝臟引發的損害。DILI 分辨率定義為肝臟生化指標值恢復正常或低于CIOMS 實驗室標準［1］，調查顯示每年10 萬居民中大約有14～24 人在藥物治療過程中可引發DILI，占藥品不良反應例數的3%～9%。DILI發病機制復雜，致病因子較多，且大多數取決于藥物理化性質和宿主因子的相互作用［2］。由于抗結核藥物致肝損傷的病程在臨床實踐中難以觀察，因此有必要建立抗結核藥物致肝損傷的動物模型。利福平可誘發肝細胞型和膽汁淤積型肝損害，異煙肼可誘發肝酶過高，抗結核藥所致的肝損傷已成為最嚴重毒副作用之一［3］。護肝益肺方為鎮江市第三人民醫院肺科協定方。該方由女貞子、五味子、甘草、虎杖、黃芪等12 味中藥組成，具有護肝解毒，斂肺止咳等功效，用于防治抗結核藥所致肝損害。既往研究表明，護肝益肺顆粒對異煙肼、利福平所致藥物性肝損害小鼠均有保護作用［4］。本文自2018年3月至2019年3月研究了護肝益肺方對異煙肼+利福平所致藥物性肝損害小鼠的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗用藥物試劑及儀器設備

1.1.1 要藥物及試劑 利福平注射液（沈陽雙鼎制藥有限公司，生產批號18070201），規格：5 mL：0.3 g；異煙肼注射液（天津金耀藥業有限公司，生產批號1704231），規格：100 mg：2 mL；水飛薊賓葡甲胺片（江蘇中興藥業有限公司，生產批號171207-314），規格：50 毫克/片，以1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）制成混懸液；羧甲基纖維素鈉購于辰昊聚合物科技有限公司；75%乙醇消毒液及甲醛組織固定液購于上海雷布斯儀器設備有限公司。

1.1.2 護肝益肺方、護肝方的制備 護肝益肺方組成：女貞子10 g、五味子10 g、甘草10 g、虎杖20 g、黃芪30 g、三七5 g、胡黃連6 g、白頭翁6 g、炙百部15 g、白及10 g；護肝方組成：女貞子10 g、五味子10 g、甘草10 g、虎杖20 g、胡黃連6 g、白頭翁6 g。取兩副方劑三倍藥材量，將藥材粉碎成粗粉，置適宜煎器中，加水浸沒藥材，浸泡適宜時間后，加熱至煮沸，分離煎出液，藥渣煎出2 次，合并各次煎出液，濃縮至適宜濃度（給藥量0.1 mL/10 g藥材）。

1.1.3 主要實驗儀器 15R 型臺式冷凍離心機（貝克曼庫爾特商貿有限公司生產），羅氏cobas 8 000全自動生化分析儀（羅氏診斷產品上海有限公司生產），Synergy2酶標儀（美國Bio-Tek公司生產），制冰機（江蘇冰歐新能源科技有限公司生產），-20 ℃冰箱（廣東福意電器有限公司生產），石蠟切片機（貝諾醫療器械有限公司生產），顯微鏡（Olympus，日本生產）。

1.2 藥理實驗方法

1.2.1 實驗動物選擇與飼養 70 只SPF 級ICR 小鼠，2～3 周齡，體質量20～22 g，雌雄各35 只，購于南京中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0049。實驗動物飼養于屏障設施內、正常喂食標準飼料。動物房內溫、濕度調節：溫度21～26 ℃，相對濕度45%～70%。適應性喂養7 d后靜脈注射給藥。本研究對動物處置符合動物倫理學原則。

1.2.2 動物分組及待測樣本采集 動物分組：將70只ICR 種小鼠分為7 組，雌雄各半。正式給藥前一日備好墊料、飼料、水，分組。空白對照組：正常飲水、喂飼料；模型組：靜脈注射給聯用藥（劑量：100 mg/kg異煙肼+400 mg/kg利福平，連續給藥2周）；陽性對照組：靜脈注射給藥（水飛薊賓葡甲胺片配成75 mg/mL的混懸液，換算成給藥量750 mg/kg，連續給藥2周）；全方低劑量組：（劑量：5 g生藥/kg，連續靜脈注射給藥2周）；全方高劑量組：（劑量：10 g生藥/kg，連續靜脈注射給藥2周）；護肝低劑量組：（劑量：2 g生藥/kg，連續靜脈注射給藥2周）；護肝高劑量組：（劑量：4 g生藥/kg，連續靜脈注射給藥2周）。除空白對照組外，其余組小鼠每天上午9 點左右給予100 mg·kg-1·d-1異煙肼＋400 mg·kg-1·d-1利福平混合藥液；每天下午3點（6 h后）針對陽性對照組及方劑組給保護藥，模型組和空白組同時間靜脈注射給生理鹽水。各組灌胃體積均為0.1 ml/10 g，均正常飲水、喂飼料。第14天禁食不禁水24 h，第2天稱重。

實驗取材：從小鼠眼眶內眥靜脈采血收集，用離心管裝至0.5～0.7 mL用于血液中生化指標的檢測；在超凈臺中取肝臟，取整塊肝組織樣本、稱濕重，統一取肝左葉用10%甲醛浸泡裝于離心管中用于肝組織病理切片制作，迅速剪取肝右葉用于肝勻漿制備。

1.2.3 肝組織病理切片的制作及觀察 統一取肝左葉，用生理鹽水洗滌后放入甲醛中固定2 d，待其脫水后，經修樣、石蠟包埋，再切成厚度5 μm 的肝組織病理切片，HE 染色后于光學顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.4 肝勻漿的制作及檢測 統一取肝右葉，用生理鹽水進行勻漿，制成10%勻漿液，于離心機中離心10 min（轉速4 000 r/min、溫度4 ℃），分離上清液。將分離的勻漿液-20 ℃保存待測。肝勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量的測定，均按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 血清生化指標的檢測 由鎮江市第三人民醫院檢驗科使用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）及總膽紅素（TBIL）的含量。1.3 統計學方法采用統計軟件SPSS 16.0進行檢驗。計量資料用的是方差分析和t檢驗，以表示；計數資料用的是χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果與分析

2.1 觀察小鼠外貌、體重和行為的差異空白對照組：毛色順白，行動敏捷，食量正常，體質量偏重且增長迅速；模型對照組：毛色無明顯變化，行動較正常組遲緩，食量偏小，排泄物呈紅色至橘紅色、較稀薄；陽性對照組：毛色無明顯變化，行動正常，食欲正常。各組體重均穩定增長，雄鼠體重較雌鼠增長較快，模型組較正常組體重增長略緩慢，陽性對照組與各保肝組體重均穩步增長且增重明顯。

2.2 觀察小鼠肝臟形態的變化實驗周期結束后將肝臟取出，用生理鹽水洗去肝表面的血漬，肉眼觀察肝臟整體。空白組：小鼠肝臟表觀呈暗紅色近似紅褐色，彈性較好。模型組：外觀有所改變，肝臟明顯腫大，顏色呈淡黃，部分肝臟表面有大量土黃色小點聚集，與暗紅色明顯不同，邊緣切面組織略寬略鈍，觸感柔軟，明顯有油膩感、彈性不足，其中個別肝臟表面黃色小點程度較嚴重，面積較大，初步論證為脂肪肝變性明顯。陽性對照組及其他保肝方組中，小鼠肝臟均比模型組質量減輕，并無明顯腫脹，肝臟組織邊緣略尖窄、切面較薄，觸摸手感較柔軟。但保肝方中，尤其以低劑量組中，仍有個別小鼠肝臟有油膩感，切面組織較其他略微寬鈍。

2.3 小鼠肝臟生化指標檢測結果由表1可看出，模型組的TBIL、ALP 均大于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），表明利福平、異煙肼藥物聯用所致急性藥物性肝損害的模型建立成功。在護肝益肺方及拆分后的護肝方中，ALT 與AST 與模型組相比差異無統計學意義，陽性對照組（水飛薊賓葡甲胺片）、各方劑組的TBIL、ALP 均小于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明水飛薊賓葡甲胺片、護肝益肺方及拆分后的護肝方對模型小鼠的肝損傷均有保護作用。可見，拆分后的護肝方對TBIL、ALP 的降低能力優于陽性組，而護肝益肺全方的解毒能力與陽性組持平。

2.4 小鼠肝臟病理學檢查對肝損害小鼠模型肝臟組織病理學的影響：正常對照組小鼠肝組織無明顯病理改變；模型組肝細胞發生廣泛的脂肪樣變性，細胞質疏松及混濁腫脹，匯管區炎性細胞浸潤及肝細胞可見少量點狀和灶狀壞死。陽性對照組及護肝方各劑型組僅個別肝細胞出現壞死，肝細胞變性壞死程度較造模組輕，匯管區可見少量炎細胞浸潤，見表2。

通過在光鏡下對各組小鼠肝組織病理切片進行觀察。空白組：切片上每個肝小葉紋路清楚，小葉中間的中央靜脈呈放射狀排列，無病變發生。門管區結構清晰、結締組織易辨認，小葉間靜、動脈及小葉間膽管無明顯病變發生。肝細胞常規排列，辨認清晰，肝實質細胞未見明顯急性肝炎、肝硬化、肝膿腫等病生理變化（圖1A）。模型組：可清晰地觀察到脂肪變性，肝竇變得狹窄，可見肝細胞體積擴增，聚集排列雜亂，小的脂肪空泡環繞在細胞核四周，脂肪空泡體積大小不一，充斥在整個細胞質中（圖1B）。陽性對照組：可依稀分辨出一些散在的脂肪變性，以微泡型脂肪變性居多，有些區域幾乎無脂肪性小泡，屬輕度脂肪性病變（圖1C）。全方低劑量組：肝細胞氣球性樣變，細胞腫脹變性，細胞質淡染。以微泡型和小泡型的脂肪變性居多，且數量稍多、屬中度變性。10例病理切片中，有4例表現出中度脂肪性病變，量化指標有所緩和但藥效不及高劑量組明顯（圖1D）。全方高劑量組：依稀分辨出微小氣泡較多，存在很輕微的脂肪性變性，可忽略不計（圖1E）。護肝低劑量組：也可分辨出一些散在的脂肪變性，以微泡型脂肪變性居多、按小泡數量屬輕度到中度病變（圖F）。護肝高劑量組：存在很輕微的脂肪性變性，可忽略不計，整體效果優于護肝常量組（圖1G）。

圖1 各組小鼠肝病理學變化光鏡圖：A為空白對照組（HE染色，×100）；B為模型組（HE染色，×100）；C為陽性對照組（HE染色，×100）；D為全方低劑量組（HE染色，×100）；E為全方高劑量組（HE染色，×100）；F為護肝低劑量組（HE染色，×100）；G為護肝高劑量組（HE染色，×100）

2.5 護肝益肺方對小鼠肝勻漿GSH、SOD、MDA的影響由表3可看出：陽性對照組、各方劑組中的SOD、GSH均高于模型組，MDA均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明水飛薊賓葡甲胺片、護肝益肺方及護肝方對肝損傷模型小鼠肝勻漿中的SOD、GSH 有升高作用，MDA 有降低作用。在陽性組與各方劑組的比較中，可見全方高劑量組對升高SOD、GSH及降低MDA水平的調控能力與水飛薊賓葡甲胺片持平，而護肝高劑量組對肝損傷模型小鼠肝勻漿中各指標的調控作用更優。

3 討論

半個世紀來，利福平、異煙肼、吡嗪酰胺等作為一線抗結核藥物常被臨床使用，但因其肝毒性引發的藥物性肝損傷常影響到抗結核治療方案的實施。治療過程中由于藥物的毒性損害或對藥物的過敏反應所致的藥物性肝損傷，臨床多表現為四肢乏力、黃疸、惡心厭油、肝臟腫大、肝區疼痛等［5］。

目前已有多種肝損傷動物模型：化學性肝損傷動物模型、藥物性肝損傷動物模型、免疫性肝損傷動物模型、酒精性肝損傷動物模型等。生物性方法要求實驗條件高且費用昂貴，限制其應用。免疫性方法是通過免疫方法造成肝損傷，主要用于通過免疫機制所致肝損傷的藥物研究。化學性方法通過化學性肝毒物質，如四氯化碳、對乙酰氨基酚等致肝損傷。對乙酰氨基酚是運用最為廣泛的一種造模藥物，在常規治療作為解熱鎮痛藥時是相對安全的、但長期或過量使用易造成肝中心小葉壞死，嚴重會惡化成急性肝功能衰竭［6］。酒精性方法發病機制較為復雜［7］，通過酒精灌胃，具有簡易方便成本低等特點，但安全性不易把控、小鼠易死亡。如何建立更優質有效的肝損傷動物模型，尚需進一步的研究和改進，為研究肝病發病機制、篩選保肝藥物等奠定基礎。當然，以抗結核藥制備肝損傷動物模型，用于評價對抗結核藥所致肝損傷保護作用，更具有科學和臨床實際意義［8］。利福平單用可導致膽紅素升高，通過協同作用加重異煙肼所引起的肝損傷。抗結核藥所引起的肝損傷與對乙酰氨基酚和四氯化碳不同，對于ALT和AST增高不明顯、但對于TBIL和ALP有明顯的升高作用，均會不同程度出現肝細胞水腫，羽毛樣、脂肪變性［9］。故本實驗以利福平+異煙肼干預制備肝損傷模型，并評價護肝益肺方對其的肝保護作用。

表1 護肝益肺方水提物對肝損害小鼠模型肝臟生化指標影響/（U/L，）

表1 護肝益肺方水提物對肝損害小鼠模型肝臟生化指標影響/（U/L，）

注：與模型組比較，aP＜0.05，ALT為丙氨酸氨基轉移酶，AST為天冬氨酸氨基轉移酶，ALP為堿性磷酸酶，TBIL為總膽紅素

表2 護肝益肺方水提物對肝損害小鼠模型肝組織病理的影響

表3 護肝益肺方水提物對肝損害小鼠的GSH、SOD、MDA的影響（n＝10）

肝臟是脂肪轉化的場所，需要經過肝靜脈運輸到身體的各個部位，肝淤血導致肝靜脈不能及時的運輸走脂肪，肝細胞中的脂肪變性變為明顯［10］。本實驗的肝臟病理檢查結果顯示，由利福平+異煙肼干預制備的模型組均不同程度出現肝細胞水腫，羽毛樣、脂肪變性。脂肪變性較為嚴重的切片中可觀察伴有大量慢性炎性細胞充斥在肝細胞中、個別可見散在的膽汁淤積等現象。有的切片中還出現微小脂肪性病毒，體積不大但數量較多；中央靜脈周圍變形較明顯，匯管區脂肪變性不明顯，屬重度脂肪性病變。以上表明由利福平+異煙肼干預制備的肝損傷小鼠模型制備成功，且符合抗結核藥作用特點。經護肝益肺全方及護肝方治療后，小鼠肝臟僅個別肝細胞出現壞死，肝細胞變性壞死程度較造模組輕，匯管區僅見少量炎細胞浸潤，表明護肝益肺全方及護肝方對抗結核藥所致小鼠肝細胞性損傷具有保護作用。

本實驗生化檢測結果顯示：護肝益肺方全方及拆方過后的護肝方能顯著降低抗結核藥造成的藥物性肝損害小鼠血清ALP、TBIL升高的水平；能顯著升高藥物性肝損害小鼠肝勻漿中SOD、GSH 降低的水平且能抑制肝組織中MDA的升高；文獻報道護肝益肺方藥中部分中藥能降低藥物性肝損害小鼠肝組織變性、甚至壞死的程度，具有保護肝細胞的作用［11］。表明護肝益肺顆粒全方能對異煙肼+利福平聯用所致藥物性肝損傷小鼠發揮較好的肝保護作用，且作用機制與抗氧化作用有關。本實驗結果與文獻報道復方中藥對異煙肼致肝損害保護作用相吻合，這為中藥復方與抗結核藥聯用治療結核病提供了實驗依據。而實驗后續中，將繼續研究護肝益肺方藥其他提取物對抗結核藥致肝損害的保護作用。