孕產婦Rh 血型系統抗體檢測和臨床意義分析

周明，王慧茹，陳洋，王敏，潘健

作者單位：中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）輸血科，安徽 合肥 230001

在臨床上除了ABO 血型系統外，Rh 血型系統最為復雜，已發現的抗原有54種，Rh血型抗體檢出率較高常引起免疫溶血性輸血反應（HTR）、造成疑難交叉配血及紅細胞輸注無效［1-2］，在新生兒溶血病（HDN）中Rh 系統約占34.56%。2015年10 月我國積極開展應對人口老齡化行動，實施全面二孩政策，目前調查孕產婦Rh血型抗體的檢出率及特異性分布情況，對于既往有不明原因流產提示、預防免疫溶血性輸血反應和新生兒溶血病具有重要的臨床意義。筆者選擇了4 680 例孕產婦，采用微柱凝膠抗球蛋白技術進行不規則抗體篩查及鑒定，共檢出56 例Rh 血型不規則抗體，調查5 種Rh 血型抗體的檢出率及發生規律，同時分析新生兒溶血病檢測陽性標本與母親血清中特異性的抗體臨床意義。今后除Rh（D）相容性輸血外推進Rh（CE）抗原相容性輸血，對預防免疫溶血性輸血反應及新生兒溶血病具有非常重要的臨床意義，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月至2018年6月中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）申請備血的孕產婦4 680例為觀察組，年齡范圍為18～43 歲，年齡（27.3±5.6）歲。妊娠次數1～4 次，妊娠（2.2±1.2）次；另選取4 590 例申請備血的男性病人為對照組，年齡范圍為0～48 歲，年齡（34.3±4.6）歲。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 儀器試劑篩選不規則抗體細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和譜紅細胞（上海市血液生物技術公司生產）、2-Me（2-巰基乙醇）；美國強生抗人球蛋白微柱凝膠卡（Ortho Clinical Diagnostics 公司）及血型專用孵育器、離心機；單克隆抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清（長春博迅生物技術公司生產）。

1.3 紅細胞不規則抗體篩查自身對照管及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號管均無凝集者表明未檢出紅細胞不規則抗體；自身對照管無凝集，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號管中至少有一管出現凝集者表明受檢者血清（血漿）含同種免疫性紅細胞不規則抗體。

1.4 紅細胞不規則抗體特異性鑒定取微柱凝膠抗球蛋白卡2張（12微孔），在12個微孔下分別標記為1～10、自身對照、陽性對照。在標記為1～10的10個微孔中分別加入1～10號配組譜紅細胞（濃度1%）各50 μL，自身對照加入1%自身紅細胞懸液50 μL、陽性對照加入1%O型RhD陽性紅細胞懸液50 μL，在標記為1～10 及自身對照的微孔中各加入受檢者血清（血漿）50 μL，陽性對照孔中加入IgG抗D試劑50 μL。如12個微孔均為陽性者為非特異性抗體或同時伴有特異性抗體，1～10 號微孔中有1 或多個微孔陽性者為特異性杭體，可根據陰、陽性反應格局，對照譜紅細胞抗原譜判定抗體特異性。

1.5 Rh血型抗體免疫球蛋白類型鑒定鹽水介質法測定IgM 類血型抗體效價，效價與裂解前具有相應血型抗原的紅細胞無變化者為IgG 類抗體，效價與裂解前具有相應血型抗原的紅細胞有變化者為IgM類，效價與裂解前有所降低、但仍有凝集反應為IgG+IgM抗體。

1.6 Rh血型抗體效價測定取出裂解后的0.1 mL血清依次倍比稀釋，配成8，16，32，64，128，256，512，1 024，采用抗球蛋白方法分別加入Rh 抗體的對應抗原的紅細胞，離心后觀察結果并記錄其效價。

1.7 新生兒溶血病試驗直接抗球蛋白試驗（DAT）：取病兒紅細胞懸液50 μL洗滌后做DAT；紅細胞放散試驗：取病兒壓積紅細胞1～2 mL用生理鹽水洗滌4次，最后一次洗液放入另一試管留作對照，用洗滌后的壓積紅細胞56 ℃熱放散。微柱凝膠抗球蛋白法使血漿及紅細胞放散液分別與篩選細胞反應，檢測紅細胞不規則抗體，方法同不規則抗體的特異性鑒定。

2 結果

2.1 Rh血型不規則抗體在我院備血標本的檢出率及分布情況就診孕產婦共備血4 680 例，Rh 血型抗體在初篩不規則抗體陽性標本中檢出56例（檢出率為1.20%），56 例抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e 孕產婦中，有妊娠史者48 例（占85.71%），其中妊娠2 次以上24例（占42.86%）；有輸血史者5例（占8.93%）；既有妊娠史又有輸血史者3例（占5.36%）。4 590例申請備血的男性病人，檢出Rh 血型抗體者共16 例（檢出率為0.35%），有輸血史者12 例（占75.00%）。Rh 血型不規則抗體檢出率及在就診人群中的分布情況見表1。

2.2 孕產婦檢出Rh血型不規則抗體特異性分布特異性分布為：抗-E 33 例（58.92%）、抗-D 10 例（17.86%）、抗-c 7 例（12.50%）、抗-cE 5 例（8.93%）、抗-C 1例（1.79%），見表2。

表1 Rh血型不規則抗體在研究人群中檢出率及分布情況/例（%）

表2 孕產婦Rh血型不規則抗體特異性分布

2.3 56 例Rh 血型抗體類型抗體免疫球蛋白類型：37 例（66.07%）為IgG、13 例（23.21%）為IgG+IgM、6 例（10.71%）為IgM，在37 ℃下均可與相應抗原的紅細胞發生凝集反應，說明具有臨床意義。

2.4 檢出Rh 血型抗體的效價情況其中效價為512 者2 例（均為IgG），效價為256 者4 例（均為IgG），效價為128 者7 例（均為IgG），效價為64 者16例，效價為32 者20 例，效價為32～4 者7 例，檢出的56例抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e效價介于4～512，效價64以上均為IgG。

2.5 新生兒溶血病的結果56例Rh血型抗體陽性的孕產婦中，新生兒紅細胞直接抗球蛋白試驗（DAT）及紅細胞放散試驗均為陽性，新生兒溶血病試驗鑒定放散液抗體與其母親Rh 血型抗體完全一致，證實10例新生兒的血清抗體通過胎盤凝集破壞胎兒紅細胞，IgG抗-D 4例，IgG抗-E 3例，IgG抗-c 2例，IgG抗-cE 1例，見表3。

確診Rh-HDN 診斷病例占同時期檢出的26 例Rh-HDN 病兒的38.46%。10 例所產新生兒被診斷為Rh-HDN，新生兒涵蓋ABO系統血型抗原和Rh系統的5種抗原，病兒臨床表現為貧血進行性加重、黃疸（＞340 μmol/L）和出血傾向，血漿中均檢出Rh血型抗體，2例檢出高效價IgG抗-D的孕婦其中查閱病歷并詢問病史，1 例多次習慣性流產，1 例出現不明原因晚期妊娠終止（孕齡＞28 周）。另外6 例孕婦Rh血型抗體效價均＞64，所產新生兒黃疸出現早進展快，嚴重病兒出現低蛋白血癥、嗜睡、角弓反張等核黃疸癥狀。有1例既無妊娠史又無輸血史者檢出Rh血型抗體，其產生原因不明。

3 討論

人類紅細胞有30 多個血型系統，Rh 血型系統是最為復雜，表達的血型抗原多達54 個，與臨床密切相關的5 種抗原是D、E、C、c、e 等，其中D 抗原性最強，還存在弱D和部分D等變異體，臨床輸血較為復雜。女性因為妊娠胎兒紅細胞經胎盤進入母體或RhCE非同型輸血等同種免疫刺激而產生同種抗體，引起嚴重的免疫溶血性輸血反應及新生兒溶血病概率會明顯增加。臨床上不規則抗體陽性和嚴重的新生兒溶血病病例多由Rh血型抗體引起，臨床表現為新生兒惡性貧血、胎兒水腫、黃疸，嚴重的導致核黃疸，在新生兒溶血病的發病方面，新生兒溶血病臨床癥狀與Rh 血型抗體數量、效價、胎兒致敏情況和胎兒代償能力密切相關［3］，嚴重者可致死胎因此預防和治療意義重大。早期新生兒溶血病的產前診斷通過羊水穿刺獲取胎兒細胞，但費用高耗時長，侵入性檢查對胎兒具有一定危險。對于妊娠史、輸血史和流產史的夫婦Rh血型檢測和產前動態監測孕產婦體內Rh血型抗體變化極有必要。

表3 產婦和新生兒血型血清學結果

本研究中人群中抗-E的比率較高，而抗-D的比率較低，另外4 680 例孕產婦中Rh 血型抗體的檢出率為1.2%，Rh血型抗體所占比率依次為：抗-E 33例（58.92%）、抗-D 10例（17.86%）、抗-c 7例（12.50%）、抗-cE 5例（8.93%）、抗-C 1例（1.79%）。孕產婦中檢出的紅細胞血型不規則抗體均多于男性，這與國內外多篇文獻報道一致［4］。分析原因有兩個：①男女體內激素調節的內分泌系統及妊娠等生理原因的免疫狀態不同，病人中多數女性有2次以上妊娠史，機體接受外界的免疫刺激機會多。②自身免疫系統紊亂產生Rh“類似抗體”，臨床可見抗-Ce、抗-c、抗-Ec、抗-e 等自身抗體［5］。2000年起《臨床輸血技術規范》第四章第5 條明確要求“常規檢查病人Rh（D）血型”，故抗-D 產生減少，僅占Rh 系統的15.63%，但其它RhCE 抗原檢測未作要求，尤其是E抗原性僅次于D，刺激依然存在，導致抗-E（c）占Rh的71.88%，研究表明我國漢族人群RhE陰性頻率遠高于RhD陰性頻率，一次隨機受RhE同種免疫概率高于RhD 2.47 倍［6］，故建議輸血前首先將RhE 作為孕婦常規檢測且RhDE同型輸血，將會大大降低抗-E產生的概率，減少不良反應發生。

Rh血型抗體通常采用凝聚胺或抗球蛋白鑒定，本研究中56 例陽性標本采用微柱凝膠抗球蛋白方法靈敏度高，未發現漏檢，免疫球蛋白類型多為IgG也有IgM。Rh 抗體溶血主要為血管外溶血，具有臨床意義多數抗體最佳反應溫度為37℃，除了單一血型抗體外，還會ABO 系統等其他紅細胞系統合并Rh 系統的溶血病。在檢出56 例孕婦血漿中的Rh血型抗體，其中2例Rh血型抗體效價均≥512發生了流產史、輸血史甚至宮內死胎，1 例Rh 血型抗體效價均≥128 出現2 次以上晚期妊娠終止（孕周＞28周），1 例Rh 血型抗體效價均≥64 多次習慣性流產。分娩的新生兒有10 例被證實其紅細胞具有臨床意義，母體被來自胎兒的紅細胞致敏產生Rh 血型抗體，自母體經胎盤進入新生兒血液循環的Rh血型抗體造成病兒溶血性貧血、缺氧、心衰，嚴重者宮內死胎，是Rh-HDN最主要的致病抗體。Rh-HDN中抗-c的重要性僅次于抗-D，可能引起嚴重新生兒溶血病，抗-C、抗-E、抗-e不常引起新生兒溶血病，即便發生也比較輕。其余5例紅細胞未被抗體致敏的新生兒母親血漿Rh 血型抗體效價均≥64，紅細胞血型抗體的效價的高低與機體免疫次數有相關性，抗體的效價與臨床意義也密切相關，胎兒紅細胞Rh抗原顯示出劑量效應，其致敏能力越強、次數越多抗體效價越高，其導致輸血免疫溶血性輸血反應及新生兒溶血病的程度也越嚴重。因此對于檢出高效價IgG型Rh 抗體的孕婦，妊娠中晚期每2 周監測，制定本實驗室危險臨界值，作為產前診斷評估胎兒發生新生兒溶血病的嚴重程度可能性、制定合理的干預預防措施［7］，效價≥512可行血漿置換治療。

目前國內絕大多數醫院臨床輸血前只進行RhD 檢測，本研究檢出抗-D 占Rh 血型抗體的8.33%，國內2015～2018年報道的免疫溶血性輸血反應及新生兒溶血病病例中由抗-D 引起的病例均高于我們［8-9］，臨床輸血施行ABO 系統和RhD 同型輸注，RhD陰性受血者基本接受RhD陰性紅細胞的同型輸注，所以經輸血所致同種免疫性抗-D 越來越少。然而Rh系統擁有豐富而復雜的遺傳多態性，同樣表現Rh 陰性的個體因人種不同而有不同的遺傳結構；另一方面由抗原陰性率和免疫原強度推測，抗-E 及抗-cE 成為相對多見的不規則抗體，相關報道也證明表達在同一條多肽鏈上的RhC/c 和RhE/e的原因使抗-E及抗-cE致免疫溶血性輸血反應及新生兒溶血病增多［10-12］，隨機輸血中E抗原和c抗原刺激機體產生IgG抗體概率最大［13］，抗-E除了在Rh系統抗體中占主要比例外，在病人所有紅細胞血型意外抗體的比例中亦是最高。Rh 系統抗體常共同出現已經產生抗-E 的DCe/DCe（R1R1）個體可能已經產生抗-e，但其抗-c較弱而未檢測出，輸入E陰性而c 陽性的紅細胞也會引起急性或遲發性溶血反應。因此我們建議在有妊娠史輸血史的孕產婦、反復輸血者、疑難交叉配血的特殊人群中，增加Rh 血型抗原分析的輸血策略，研究Rh抗原E、C、c、e在本地區的頻率分布，建立抗-c、抗-e 稀有血型供血群，選擇不含相應抗原或Rh血型相同血液進行輸注，對保障孕產婦輸血安全和降低Rh-HDN意義重大。