CysLT2受體拮抗劑HAMI3379抑制LPS誘導小鼠小膠質瘤細胞系的炎性反應

顧勝龍，李明星，應苗法，方三華，饒躍峰，趙 蕊*

(1.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院 藥劑科，浙江 杭州 310016； 2.浙江大學醫學院 公共技術平臺，浙江 杭州 310058； 3.浙江大學醫學院附屬第一醫院 藥劑科，浙江 杭州 310003)

腦缺血損傷是一個復雜的病理生理過程，在腦血管病中，缺血性腦損傷約占80%，其發病率高、致殘率高和病死率高的特點，與心臟病、腫瘤構成人類的三大致死病因，嚴重影響著人類的健康和生活質量[1]。常見的發病機制包括能量代謝障礙、細胞內鈣超載、興奮氨基酸毒性、氧化應激損傷、炎性反應及神經細胞凋亡等[2-3]。小膠質細胞的活化在腦缺血損傷后細胞免疫及炎性反應過程中扮演著重要的作用，活化的小膠質細胞釋放大量的炎性因子、NO及過氧化物，導致神經元的凋亡，凋亡的神經元細胞能夠激活小膠質細胞，引起炎性反應的惡性循環發生[4]。

5-脂氧酶產物半胱氨酰白三烯(Cysteinyl leukotriene, CysLT)是一類重要的炎性介質，在外周和中樞均具有調節免疫、炎性反應及組織的修復作用。研究發現，在大鼠局灶性腦缺血損傷后，CysLT1和CysLT2表達增加，CysLT1受體拮抗劑孟魯司特(montelukast)、普魯司特(pranlukast)能夠抑制CysLT1的表達，減輕炎性反應及神經元損傷，改善腦缺血損傷[5-6]。另有研究發現，采用100 ng/mL LPS處理BV-2細胞24 h，CysLT2的表達顯著上調，誘導炎性反應的發生及神經元的損傷[7]。目前，已出現的CysLT2受體拮抗劑較少，選擇性拮抗劑HAMI3379對炎性反應的調控及作用機制仍不明確。本研究主要探究CysLT2受體抑制劑HAMI3379對LPS誘導小膠質細胞炎性反應的調控作用及其可能的作用機制，以期為將來腦缺血損傷治療藥物的開發提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：CysLT2受體抑制劑HAMI3379(Cayman公司)；LPS (Sigma Aldrich公司)；DMEM培養基、胎牛血清(Gibco公司)； CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；小鼠IL-1β、TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒(酶免試劑盒商城)；BCA試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；Iba1抗體(Novus生物制品公司)； PKCα、IKBα、NF-κB p50和p65、β-actin 抗體(Proteintech公司)。

1.1.2 細胞：小鼠小膠質瘤細胞系BV-2 (上海澤葉生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養與分組：于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于含有5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養BV-2細胞；待細胞貼壁培養24 h后，更換成含有LPS的完全培養基繼續培養24 h或HAMI3379預培養30 min。將BV-2分為6組：對照組、LPS(100 ng/mL)組、HAMI3379(0.01、0.1和1 μmol/mL)組、LPS+ HAMI3379組。

1.2.2 免疫熒光染色鑒定BV-2細胞：將BV-2細胞接種至24孔板，進行細胞爬片，置于恒溫培養箱中培養24 h，棄去培養基，PBS洗2次，向各孔加入4%的多聚甲醛室溫固定30 min，棄去固定液，PBS洗3次；加入0.5% Triton-X100室溫透化30 min，棄去透化液，PBS洗3次；加入10%驢血清封閉30 min，去封閉液，加入Iba1山羊多克隆抗體(1∶300)，4 ℃過夜孵育；加入Cy3標記的驢抗山羊Ⅱ抗，37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h；DAPI染核液避光復染15 min，將蓋玻片置于載玻片上，封片，熒光倒置顯微鏡拍照觀察。

1.2.3 CCK-8法檢測BV-2細胞的增殖率：取對數增殖期的BV-2細胞制成細胞懸液，調整細胞濃度并接種至96孔板，5×103個/孔，置于培養箱中貼壁培養24 h；換成不含胎牛血清的DMEM培養16～18 h，然后按照實驗分組，加入HAMI3379預培養30 min，換成含有LPS的培養基繼續培養24 h；待培養結束，向各孔加10 μL的CCK-8溶液，置于培養箱中孵育1 h，用酶標儀測量各孔在450 nm處的吸光度A值，并計算細胞的增殖率。

增殖率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)

1.2.4 ELISA檢測BV-2細胞上清液中細胞因子的水平：取對數增殖期的BV-2細胞接種至6孔板，5×104個/孔，置于培養箱中貼壁培養24 h；加入HAMI3379預培養30 min，換成含有LPS培養基繼續培養24 h；收集細胞上清液，1 500 r/min離心15 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書進行試驗，檢測上清液中IL-1β、TNF-α和IL-10的含量。

1.2.5 Western-blot檢測PKCα、IKBα、NF-κB p50和p65蛋白的表達：取對數增殖期的BV-2細胞接種至6孔板，5×104個/孔，置于培養箱中貼壁培養24 h；加藥處理24 h；待培養結束后，收集細胞，加入RIPA液裂解細胞，14 000 r/min離心10 min；取上清液，BCA試劑盒測量蛋白的濃度，取30 μg蛋白液與上樣緩沖液(4∶1)混合，10%的SDS-PAGE分離蛋白，采用濕法轉膜將目標蛋白轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，孵育PKCα、IKBα、p50、p65、β-actin(1∶1 000)兔多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜；辣根過氧化酶標記山羊抗兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h，ECL法化學發光；采用Image J軟件對蛋白條帶進行吸光度值分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 BV-2細胞的培養及鑒定

BV-2細胞貼壁后，少部分呈分支狀(圖1A)；BV-2細胞經LPS激活后胞體變大變圓，軸突增加，呈阿米巴樣 (圖1B)；用小膠質細胞特異的Iba1抗體進行熒光染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察，細胞質呈紅色熒光，細胞核被染成藍色(圖1C)。

2.2 HAMI3379對LPS誘導BV-2細胞增殖的影響

與對照組相比，LPS能夠顯著增加BV-2細胞的增殖率(P<0.05)；與LPS組相比，用HAMI3379預處理BV-2細胞30 min后，細胞的增殖率顯著降低(P<0.05)，LPS+ HAMI3379 (1 μg/mL)對BV-2細胞增殖抑制作用最大(表1)。

A.morphology of adherent culture of BV-2 cells；B.morphology when BV-2 cells were activated；C.morphology of BV-2 cells were observed by immunofluorescence staining

圖1 BV-2細胞的形態學觀察和免疫鑒定
Fig 1 Morphological observation and immunological identification of BV-2 cells

表1 LPS和HAMI3379對BV-2細胞增殖的影響

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with LPS group.

2.3 HAMI3379對細胞上清液中炎性因子含量的影響

與對照組相比，LPS能夠顯著增加細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量，降低IL-10的含量 (P<0.05)；1μg/mL HAMI3379能夠顯著降低IL-1β的含量(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+ HAMI3379組IL-1β、TNF-α的含量顯著降低，IL-10的含量顯著增加(P<0.05)(圖2)。

2.4 HAMI3379對LPS誘導BV-2細胞中PKCα、IKBα、NF-κB p50、p65蛋白表達水平的影響

與對照組相比，LPS能夠顯著上調PKCα、IKBα、p65蛋白的表達(P<0.05)，但對p50蛋白的表達無顯著性改變；與LPS組相比，HAMI3379+LPS組PKCα、IKBα、p50和p65蛋白的表達水平均顯著降低(P<0.05) (圖3)。

3 討論

正常情況下，小膠質細胞呈分枝狀，細長的突起感受周圍微環境變化，通過免疫監視、突觸修剪及產生神經營養因子如BDNF、IGF-1調控神經元的分化和凋亡，維持中樞神經系統動態平衡。在腦缺血損傷后，小膠質細胞迅速活化，由分枝狀變成阿米巴樣，向損傷的中心區遷移，且釋放大量的炎性因子如白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6及細胞間細胞黏附分子(intercellular cell adhesion molecule, ICAM)等，誘導炎性反應的發生，引起神經元的凋亡[8]。在該研究中，發現LPS刺激BV-2細胞24 h后，小膠質細胞的形態變為阿米巴樣，呈激活狀態。已有的研究發現，核轉錄因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)等信號通路參與了腦缺血損傷的發生過程[9]。NF-κB是腦缺血損傷后炎性反應發生的關鍵因子，腦缺血損傷發生后，NF-κB信號被激活并轉移至細胞核，促進ICAM的表達及介導炎性因子的分泌。另有研究發現，LPS能夠誘導BV-2細胞的激活，茴香醇通過下調NF-κB和JNK信號通路，抑制BV-2細胞的活化，產生抗炎作用[10]。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with LPS group圖2 HAMI3379對細胞上清液中細胞因子釋放的影響Fig 2 Effect of HAMI3379 on the release of cytokines in the n=3)

A.the relative protein levels of PKCα and p-PKCα; B.the relative protein levels of p50 and p65;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with LPS group

圖3 HAMI3379對BV-2細胞中PKCα、IKBα、p50和p65蛋白的表達水平的影響

已有的研究證實，CysLT2受體介導了腦缺血損傷后炎性反應及神經損傷的調控。在氧和葡萄糖剝奪的星形膠質細胞中，CysLT1和CysLT2受體表達上調，CysLT1受體促進細胞的增殖，CysLT2受體介導細胞的凋亡[11]。另外，LPS與受體作用會誘導炎性反應的發生；在LPS刺激的BV-2細胞中，CysLT2受體的表達上調并轉移至細胞核，促進炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放，誘導神經元的凋亡，沉默CysLT2能夠逆轉此結果[7]。在MACO法構建大鼠腦缺血損傷模型中，腹腔注射CysLT2拮抗劑HAMI3379能夠減輕腦梗死體積，抑制炎性因子的釋放，減輕神經元的損傷[12]。

本研究發現，LPS能夠刺激BV-2細胞的活化，促進細胞的增殖，細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量顯著增加，炎性和免疫抑制因子IL-10的分泌顯著降低，且PKCα、IKBα和p65的表達也顯著增加；采用CysLT2受體拮抗劑HAMI3379單獨處理BV-2細胞，細胞因子TNF-α、IL-10的含量及p50、p65的表達改變均無統計學意義，但IL-1β的含量顯著降低；HAMI3379預處理BV-2細胞30 min，再用LPS處理BV-2細胞24 h，HAMI3379能夠顯著抑制LPS誘導的細胞增殖，抑制細胞上清液中TNF-α、IL-1β的分泌，抗炎因子IL-10的分泌增加，且抑制PKCα、IKBα、p50、p65蛋白的表達；由此可知，LPS通過活化PKCα/NF-κB信號通路，促進炎性因子的釋放，誘導炎性反應。

綜上所述，HAMI3379能夠抑制LPS誘導的小膠質細胞增殖，抑制促炎因子的釋放；其作用機制是HAMI3379通過抑制PKCα/NF-κB信號通路的活化，抑制LPS與其受體的相互作用，發揮抗炎作用。