骨肉瘤細胞脫逸化療誘導的細胞衰老可重新增殖成瘤細胞

張 良，劉明永，劉 鵬，薛 鑫，張良民，郭喬楠，趙建華

(1.陸軍軍醫大學 大坪醫院 脊柱外科，重慶 400042；2.陸軍軍醫大學 新橋醫院 病理科，重慶 400037)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS) 是臨床上比較常見且死亡率占第2位的惡性腫瘤，主要發生在青少年[1]。很多情況下，確診骨肉瘤時已經是中后期，此時很難采取手術完全切除。通常會采取手術配合術前/術后化療即新化療技術進行治療。雖然化療近年來取得了巨大進展[2]，但新化療方案還無法完全清除體內的腫瘤細胞，這些細胞，部分以細胞衰老的狀態存活下來[3-5]。它們在長期存活的過程中，可能會脫逸細胞衰老狀態重新進入細胞周期進行增殖，成為骨肉瘤復發的種子細胞，這方面的研究較少。本實驗運用多柔比星(doxorubicin，DOX)誘導骨肉瘤細胞U2OS和MG63產生衰老的細胞為模型。觀察衰老骨肉瘤細胞能否脫逸細胞衰老和重新增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級(月齡6～7周)雄性BALB/C裸鼠(陸軍軍醫大學實驗動物中心，許可證號：11401300093570)。

1.1.2 細胞系：人骨肉瘤細胞系U2OS和MG63(中國典型培養物保藏中心)。

1.1.3 主要藥品和試劑：一抗p-p53、p-Rb和GAPDH (Santa Cruz公司)；p-γH2AX是DNA雙鏈斷裂(DSBs)的分子標志分子，在細胞衰老時表達水平上升，一抗p-γH2AX(Beverly公司)。衰老相關的β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天生物研究所)，RPMI-1640、胎牛血清(FBS) 和0.25%胰蛋白酶-EDTA(Hyclone公司)。DOX(Pfizer公司)，其他試劑和藥品(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 脫逸率：將U2OS和MG63以1×106個細胞接種于6孔板中，貼壁過夜，添加DOX終濃度為0.25 μmol/L，作用4 d，而后更換成不含DOX培養基繼續培養。在培養過程中再次出現克隆增殖時計算脫逸率，脫逸率=克隆數/開始接種細胞數。

1.2.2 細胞計數：用0.25% 胰蛋白酶EDTA消化，使細胞分散成單個細胞，錐蟲藍染色排除死細胞，細胞計數板進行計數。

1.2.3 衰老相關的β-半乳糖苷酶染色：按試劑盒說明書對細胞進行衰老相關的β-半乳糖苷酶染色，染色16～20 h，在光鏡下衰老細胞呈現藍染。計數藍染的細胞比例。

1.2.4 Western blot檢測p-p53、p-Rb和p-γH2AX蛋白:提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度；取等量蛋白(50 μg)，上樣，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；一抗抗體(1∶1 000)、GAPDH單克隆抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG(1∶5 000) 室溫孵育2 h，洗膜3 次，每次10 min；加顯色劑，Chemi Doc XR+凝膠成像儀掃描成像，條帶分析測定使用Image Lab程序。

1.2.5 軟瓊脂糖集落形成實驗: 6孔板孔底首先鋪上 1.5 mL 0.36%軟瓊脂糖，放置4 ℃冰箱中使之固化，在固化的瓊脂糖上面，接種0.36%軟瓊脂糖和3.0×103個細胞的混合液。待上層固化后，置入培養箱中培養，培養14 d后，在相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 裸鼠成瘤實驗: 在裸鼠的右腹股溝區皮下接種 0.1 mL細胞懸液 (1×107個細胞/mL)，腫瘤體積=[長(L)×寬 (W)] 2/2。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DOX可誘導U2OS和MG63 SA-Gal 染色陽性和衰老相關蛋白p-p53、p-Rb和p-γH2AX

用0.25 μmol/L DOX持續作用U2OS或者MG63，從第2天開始出現SA-Gal 染色陽性細胞，到第4天達到平臺期，這時超過90%的細胞呈SA-Gal染色陽性(圖1A)。DOX持續作用可以導致U2OS或者MG63細胞中p-p53、p-Rb和p-γH2AX明顯升高(P<0.05)(圖1B)。

2.2 衰老的腫瘤細胞可以脫逸衰老重新增殖

DOX持續作用U2OS或者MG63 4 d后，90%以上的骨肉瘤細胞被誘導衰老。更換不含DOX的培養基連續培養細胞75 d后，觀察到有細胞重新增殖(圖2)，脫逸率為1.23% 100萬。

2.3 逃逸衰老的細胞具有形成腫瘤細胞的能力

經過14 d的培養，衰老的細胞未形成明顯的克隆，但是脫逸衰老的細胞具有形成克隆的能力 (圖3)。裸鼠成瘤實驗表明，在45 d前U2OS和MG63母細胞形成的腫瘤比脫逸衰老細胞形成的腫瘤大，然而55 d后脫逸衰老細胞形成的腫瘤要比其母細胞形成的腫瘤大(圖4A)。將移植后55 d的腫瘤解剖，也明顯觀察到脫逸衰老組細胞形成的腫瘤明顯大于其母細胞組(圖4B)。

3 討論

體細胞在體外培養時，經過一定次數分裂后會自動進入穩定和不可逆的分裂停滯狀態，稱復制性衰老。其原因可能與端粒隨細胞分裂而進行性縮短有關。除端粒縮短外，如氧化應激、射線損傷、化療藥物及某些原癌基因激活等, 亦可誘導細胞衰老，稱為應激誘導的過早衰老(SIPS)。它們具有相似的特征：如停止在G1或G2期、細胞扁平、細胞內顆粒增多、DNA 損傷反應激活、p53- p21waf1和p16INK4-Rb 通路激活，衰老相關的β-galactosidase (SA-β-Gal)染色陽性等[6]。

A.1×106U2OS and MG63 cells were incubated with DOX and the percentages of SA-β-gal-positive cells were also measured by at mentioned time points; B.phosphorylated of SIPS-related regulators cells were treated with DOX for 1 to 9 hours, and phosphorylated p53, Rb and γH2AX were measured by Western blot;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

圖1 DOX誘導骨肉瘤細胞U2OS和MG63 SA-Gal 染色陽性及衰老相關蛋白p-p53、p-Rb和p-γH2AX明顯升高

A.U2OS or MG63 cell treated with DOX, 1×106cells were treated with DOX for 4 days, and then were cultured without DOX for up to 75 days, cells were counted every 5 days; B.representative images at different time point among groups

圖3 瓊脂糖形成實驗觀察到逃逸衰老細胞具有集落的能力

A.invivoevaluation of tumor formation 1×106parent U2OS or MG63 or SEOS cells were injected subcutaneously in nude mice, volume of tumors was calculated at setting points; B.representative images at different time point among groups;*P<0.05 compared with U2OS or MG63 group at the corresponding time

骨肉瘤常規的化療藥物有阿霉素(DOX)、氨甲喋呤和順鉑等，這些藥物能誘導包括骨肉瘤細胞在內的多種腫瘤細胞衰老和凋亡。衰老和凋亡是抑制腫瘤細胞增殖的重要機制。然而衰老和細胞凋亡不同，凋亡是死亡的一種方式，衰老的細胞沒有死亡，只是進入了一種不同于靜止期細胞的非增殖狀態，衰老細胞增殖停止，但是仍然有活性[7-9]。有報道[3-5]，衰老的細胞可能被吞噬細胞清除，也可能存在很長時間。這種存活的細胞最終的命運會是什么？本實驗觀察到在阿霉素處理4 d后，超過90%的U2OS或MG63進入衰老狀態；在撤出阿霉素后，再繼續培養一段時間，細胞數目顯著增加，提示有衰老細胞脫逸阿霉素誘導的衰老狀態重新增殖。通過對脫逸衰老細胞集落形成能力及裸鼠成瘤能力的評估，證實脫逸衰老的細胞具有成瘤能力。

衰老細胞增殖停止，但是仍然有活性，能分泌多種可溶性因子即衰老相關的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)。EGF和IL-6等多種因子分泌增加在其他衰老細胞中也被觀察到[7-9]。骨肉瘤是高表達EGFR腫瘤[10]，為SASP發揮作用，起到放大作用。EGFR/PI3K/Akt 通路可以調控SOX2表達[11]。在干細胞中SOX2 和EGFR構成一個正反饋環路。因此，衰老的腫瘤細胞脫逸衰老可能同這些分子相關，需要進一步實驗證實。

本研究揭示了衰老骨肉瘤細胞能夠脫逸細胞衰老重新增殖成瘤能力更強，它可能成為骨肉瘤復發的種子細胞，引起骨肉瘤復發。