25 株草菇菌株的遺傳多樣性*

馬慶芳，張丕奇，陳 鶴，馬銀鵬，劉佳寧，戴肖東，韓增華，孔祥輝，張介馳**

（1.黑龍江省科學院 微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學院 高技術研究院，黑龍江 哈爾濱 150010）

草菇（Volvariella volvace），又名苞腳菇、中國蘑菇，屬于擔子菌亞門（Basidiomycatina） 層菌綱（Hyoenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 光柄菇科（Pluteaceae） 草菇屬（Voluariella）[1]。其味道鮮美、營養豐富，是一種深受民眾歡迎的食用菌[2]。草菇屬高溫型菌類，喜溫喜濕，腐生于糞草、秸稈等纖維類基質上，是我國栽培食用菌中方法最簡單、出菇最快、栽培原料最豐富的菌類[3-4]。黑龍江科學院微生物所從事草菇研究多年，已完成寒地條件整棒玉米芯生料栽培草菇示范推廣，馴化栽培草菇V23、V35 兩個菌株，生物轉化率達30%以上[5]。為提高栽培效益，篩選更多的適宜寒區生產的草菇菌株，本所從廣東、福建、江蘇、湖北、山東、河北等省共引進25 個菌株，將表觀形態與ISSR 分子標記技術相結合，對草菇菌株的遺傳多樣性進行研究，確認菌株間親緣關系，為草菇栽培適應性品比試驗奠定基礎，縮短選種周期。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株來源于廣東、福建、江蘇、湖北、山東、河北及黑龍江省科學院微生物研究所菌種保藏中心，共25 株，供試菌株具體情況見表1。

表1 供試菌株Tab.1 Strains of Volvariella volvace used in the study

1.2 供試引物

根據文獻，從UBC 公布的ISSR 引物中篩選出20 條供試引物，由上海生工合成，其序號及引物序列見表2。

表2 供試引物Tab.2 Primers used in the study

1.3 草菇菌株表觀形態觀察

利用cPDA 培養基觀察不同菌株的形態[6]。取3 mm×3 mm 供試菌株塊接入cPDA 平板培養基中央，每個菌株3 個重復，30℃恒溫培養7 d，觀察不同菌株的菌絲形態、生長速度、色素顏色等表觀生長形態。

1.4 草菇菌株DNA 指紋圖譜（ISSR） 分析

1.4.1 菌絲培養與總DNA 提取

利用PD 培養基進行菌絲培養，接種后28℃靜止培養5 d，100 目濾網收集菌絲，無菌雙蒸水沖洗2 次，擠去水分，加入液氮研至糊狀，使用TIANGEN 公司新型植物基因組DNA 提取試劑盒提取草菇菌絲體DNA，于-20℃冰箱中保存備用。

1.4.2 ISSR 擴增

PCR 擴增總體積為20 μL，使用2×Tap PCR MasterMix（含染料） DNA 聚合酶，15 ng～25 ng 模板DNA，無菌雙蒸水補足體積，試驗以無菌雙蒸水代替模板DNA 作陰性對照。ISSR-PCR 反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃復性40 s，72℃延伸70 s，進行30 個循壞；最后72℃延伸7 min。PCR 產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，Gel Safelight R＆B Mix 染色，凝膠成像掃描記錄結果。將瓊脂糖凝膠上出現DNA 片段的記為1，不出現的記為0，統計后用NT-SYS 軟件體系進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同草菇菌株表觀形態比較

2.1.1 不同草菇菌株生長速度比較

不同草菇菌株在cPDA 培養基上的生長速度差異較大，具體生長速度情況見圖1。

如圖1 所示，根據不同菌株生長速度快慢將其分成7 組，第1 組：草菇1 號，生長速度最快，平均日生長速度7.45 mm·d-1；第2 組：包括草菇2 號、3 號、5 號、8 號、9 號、16 號和21 號7 株菌株，生長速度較快，平均日生長速度在6.75 mm·d-1～7.17 mm·d-1之間，低于草菇1 號，但差異不顯著；第3組：包括4 號、6 號、7 號、11 號、13 號、14 號、15 號、17 號、18 號和23 號10 株菌株，平均日生長速度在6.28 mm·d-1～6.52 mm·d-1之間，略低于第2 組，與第1 組1 號菌株相比差異顯著；第4 組：包括草菇10 號、24 號和25 號3 株菌株，生長速度中等，平均日生長速度在5.77 mm·d-1～5.87 mm·d-1之間，與1 號菌株相比差異顯著；第5 組：20 號菌株，平均日生長速度為5.47 mm·d-1；第6 組：包括19 號和22 號2 株菌株，生長速度較慢，平均生長速度分別為4.62 mm·d-1和4.71 mm·d-1，與前5 組菌株相比差異顯著；第7 組：12 號菌株，生長速度最慢，平均日生長速度僅為3.50 mm·d-1，與前6 組菌株相比差異顯著。

草菇菌絲生長速度與菌絲培養的生物量有關，生物量的積累對草菇子實體形成和生長有著重要影響[7]。根據圖1 結果以生長速度作為初篩指標，選擇生長速度較快的前3 組菌株的1 號、2 號、3 號、4號、5 號、6 號、7 號、8 號、9 號、11 號、13 號、14 號、15 號、16 號、17 號、18 號、21 號和23 號進行栽培篩選試驗，而后4 組的10 號、12 號、19號、20 號、22 號、24 號和25 號草菇生長速度慢，不宜作為寒區栽培的菌株。

2.1.2 不同草菇菌株形態比較

不同草菇形態結果見圖2。

如圖2 所示，依據草菇菌絲形態、氣生菌絲著生類型、菌絲狀態及基質顏色，將25 個草菇菌株劃分成4 個組群，第1 組群：氣生菌絲粗壯旺盛，氣生型，呈無序棉花糖狀，培養基質黃色，包括1 號、5 號、16 號、22 號、23 號和24 號6 個菌株；第2組群：氣生菌絲粗壯旺盛，氣生型，呈無序棉花糖狀，培養基質紫色，包括2 號、3 號、7 號、8 號、9 號、10 號、11 號、14 號、17 號、18 號、19 號、20 號、21 號和25 號14 個菌株；第3 組群：氣生菌絲細弱而少，匍匐型，附著于培養基表面，培養基表面呈褶皺狀，培養基質紫色，包括4 號、6 號、13 號和15 號4 個菌株；第4 組群：12 號菌株，氣生菌絲呈粗索狀密集放射狀排列，匍匐型，附著于培養基表面，培養基質顏色黃色。

2.2 不同草菇菌株DNA 指紋圖譜（ISSR） 分析

2.2.1 ISSR 標記鑒別草菇菌株指紋圖譜

本試驗共選用了20 個ISSR 引物，有13 個引物對供試的25 個草菇試驗菌株有很好的擴增效果，擴增條帶清晰，重復性好，菌株的ISSR-PCR 電泳圖譜結果如圖3、圖4 所示。

從圖3、圖4 中可以看出，PCR 產物片段大小在250 bp～3 060 bp 之間，每個引物可擴增的多態性條數不等，為8 條～20 條，平均每個引物擴增出的條帶15.30 條，不同草菇菌株擴增出的譜帶差異明顯。利用13 個ISSR 引物對25 個供試草菇菌株進行PCR 擴增，共得到199 條DNA 帶，多態性條帶153 條，其中共有帶為46 條，多態性比率為76.88%，說明收集到的草菇菌株具有豐富的遺傳多樣性，彼此間存在著較明顯差異。

2.2.2 ISSR 方法鑒別草菇菌株聚類分析

根據ISSR-PCR 擴增結果，用NT-SYS 軟件體系進行聚類分析，菌株聚類分析情況見圖5。

從圖5 可以看出，25 個供試草菇菌株間的遺傳相似水平在0.53～1.00 之間，在遺傳相似水平為0.53時將12 號菌株（銀絲草菇）與其他草菇菌株區分開，確認銀絲草菇與其他草菇菌株之間的遺傳差異較大。其他草菇菌株間相似系數在0.77～1.00 之間，在相似系數0.90 時可將供試的25 個菌株分為8 個組群，第1 組群包括1 號和5 號2 個菌株；第2 組群包括3 號、7 號、8 號、9 號、10 號、19 號和21 號7 個菌株；第3 組群包括16 號、23 號和24 號3 個菌株；第4 組群包括11 號、14 號、17 號、20 號和25號5 個菌株；第5 組群包括4 號、6 號、13 號、15號和18 號5 個菌株；2 號、12 號和22 號與其他菌株遺傳距離均很遠，各自單獨為一組群。

24 號菌株是23 號V35 栽培的子實體分離純化所得，檢測遺傳相似系數為1.00；11 號菌株和25號菌株都是草菇9715，分別引自華中農業大學和山東莘縣食用菌研究所，遺傳相似系數為1.00，確認為同一菌株。遺傳學上認為，當相似系數高達95%以上時可以確定為同一種內不同菌株[8]，3 號和7 號菌株之間，4 號、6 號和15 號菌株之間（6 號與15號同名），11 號、14 號、17 號和25 號菌株之間，8號、19 號和21 號菌株之間，16 號、23 號和24 號菌株之間，相似系數高于95%，而且表觀形態也很相似，可確認為同一菌株或是同一種內的不同菌株；而5 號、14 號、22 號3 個菌株引自不同單位，名稱都是草菇V97，但表觀形態和ISSR 聚類分析差異都很大，可能是同名異物菌株。說明草菇菌種不同生產廠家相互引種后又各自保藏命名，存在同名異物、同物異名現象。

3 討論

以自然生態環境和傳統農藝為基礎發展起來的草菇產業，菌種是最重要的基礎材料，尤其是“南菇北移”的高溫菇種草菇[9]。黑龍江使用的生產菌株均是引種所得，菌種選擇是關系生產成敗和提高栽培效益的一項重要措施。通過將表觀形態與ISSR 分子標記技術相結合，確認25 個草菇菌株間親緣關系，將以此為依據初篩出作為栽培試驗的生產菌株。

草菇菌種應用傳統的形態學方法鑒定，易受環境因素影響，而且草菇菌株個體分化程度低，可供選擇的特征性狀有限，形態學區別不大[10]。通過使用cPDA 培養基，30℃恒溫培養條件下，依據草菇的表觀形態將25 個供試草菇菌株劃分成4 個組群。

ISSR 分子標記是直接從DNA 水平上檢測基因組DNA 的多態性，不受環境條件和發育階段的影響[11-13]，擴增條帶清晰、多態性強、重復性好，結果統計時主觀判斷少。在黑木耳[14]、草菇[15]、羊肚菌[16]、杏鮑菇[17]、香菇[18]、姬松茸[19]等食用菌品種的鑒定及親緣關系研究中已有成功報道。在ISSR 分析中，在遺傳相似水平為0.90 時將25 個供試草菇菌株劃分成8 個組群，與表觀形態劃分的組群相比，是將表觀形態劃分的4 個組群又進行進一步的細化分組。以表觀形態為依據劃分出的第1 組群，ISSR分子技術將其細分成3 個組群；以表觀形態劃分出的第3 組群和第4 組群，與ISSR 分子標記劃分組一致；表觀形態劃分出的第2 組群，ISSR 分子標記將其劃分為4 個組群，其中18 號菌株與以表觀形態看劃分的第3 組群的4 號、6 號、13 號和15 號歸為一群，與表觀形態歸類有差異。以此次草菇菌株遺傳多樣性分析為依據選出18 個菌株進行栽培比較試驗，初步篩選出2 號、5 號、11 號和23 號4 個菌株耐低溫能力強，棚室內保持溫度在24℃以上即可正產出菇，可在寒區推廣應用。這四個菌株，分屬于聚類分析中的4 個組群，特別是2 號菌株與其他菌株間相似系數為0.80，說明所選菌株具有一定的遺傳多樣性。