油菜細胞質雄性不育恢復基因分子標記的研究進展

尹明智 胡 燕 張 瑜 楊勝潔 楊 露

（遵義師范學院生物與農業科技學院，貴州遵義 563006）

油菜CMS系統中應用最廣是pol CMS和ogu CMS。其中，ogu CMS僅在歐洲應用較多，我國及世界大部分地區主要是利用pol CMS，并選育了一大批優良雜交種應用于生產。近年來，隨著育種技術水平的提高，陸續出現了一些其他類型的CMS系統，如Nsa CMS[1]、hau_CMS[2]等。由于CMS育性能被恢復基因恢復，因此選育恢復系實現“三系配套”是油菜雜交育種的重要內容。常規育種中選育恢復系的有效方法是通過雜交轉育、成對測交鑒定來選擇含恢復基因的種質資源，然而這種方法的工作量大，且周期長。分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）可以實現在早期世代對恢復基因進行鑒定，可以有效加速恢復材料的選育過程、縮短育種周期，達到提高育種效率的目的[3]。因此，油菜細胞質雄性不育恢復基因的分子標記研究在近年來深受重視。本文對pol CMS、ogu CMS以及其他CMS系統的恢復基因分子標記研究進行了綜述，以期為進一步開發恢復基因的分子標記、建立恢復基因MAS技術體系提供參考。

1 pol CMS恢復基因的分子標記研究

自pol CMS被發現以來，科研人員就著手選育其恢復系，對其恢復基因進行了大量的研究。研究表明pol CMS的恢復基因由1-2對主效基因控制[4-5]。Jean等鑒定出與恢復基因緊密連鎖的10個RFLP標記以及1個RAPD標記，其中1個RFLP標記CRFl與Rfp1和Rfp2完全連鎖[6-7]。王俊霞篩選到與Rfp連鎖的兩個RAPD標記S1019．720與S1036．810，并成功轉化為 SCAR 標記（SCS1O19．720和SCS1O36．745），還找到了分布于Rfp兩側的3個RFLP標記，其中1個標記與恢復基因的遺傳圖距是18．0cM[8]，此外還篩選到2個RAPD標記AH19690和AI16830。這兩個RAPD標記位于pol CMS恢復基因的同側，遺傳距離分別為5．9cM和13．6cM，有利于進一步利用分子標記選育pol CMS的新恢復系[9]。

劉平武等篩選了RAPD標記引物648條、SSR標記引物472對和AFLP標記引物256對，通過分析獲得了2個連鎖標記，其中分子標記E7P16230與目標基因的遺傳距離為4．3cM，標記S1-500與目標基因的遺傳距離為10．8 cM[10]。采用BSA法，趙振卿篩選了AFLP標記引物3072對，找到了與Rfp基因連鎖的標記24對，最近的標記距Rfp基因位點為0．4cM，并將兩個距離較近的AFLP標記轉化成了SCAR標記，結果發現標記SCAPO612ST與恢復基因位點連鎖最緊密，且適用性更為廣泛，可用于MAS育種[11]。Zeng FQ等通過構建BC1群體，從1024個AFLP標記中篩選到13個與Rfp基因位點連鎖的標記，并將其中5個AFLP標記轉化為更為穩定的SCAR標記，并將Rfp基因定位在N18連鎖群上[12]。蔡強篩選了AFLP標記引物3840對，獲得與Rfp基因緊密連鎖的標記15個，其中與恢復基因遺傳圖距最近的僅為0．65 cM[13]。Yun Li等[14]通過實驗研究獲得了一個與 Rfp 基因緊密連鎖的SSR標記KBrDP1，其與Rfp基因的遺傳圖距僅為0．2cM。Zhi Liu[15]等利用公共數據庫開發了86個SSR標記和115個SCAR標記，結果有13個標記與Rfp基因緊密連鎖。這些研究加快了對Rfp基因的克隆以及優良恢復系的選育。

2 Ogu CMS恢復基因的分子標記研究

Delourme R等篩選了RAPD引物138個，從中獲得了4個與Rfo基因完全連鎖的標記，通過研究成功將這4個標記轉化成了更穩定的SCAR標記，并將轉移到甘藍型油菜中帶有恢復基因的蘿卜染色體片段定位在第15連鎖群上[16-17]。Mats Hanse 等通過分析RAPD引物960條，其中有14條與Rfo基因連鎖，有4個RAPD標記可用于恢復基因的MAS育種[18]。Maruyama S等采用BSA法獲得了與Rfo基因連鎖的RAPD標記7個，這些標記分布在Rfo基因的兩側，其中OPHll410與Rfo基因遺傳圖距是1．2cM，是離目標基因遺傳距離最近的一個標記[19]。后來他們通過構建F2群體進行分析，篩選了AFLP標記32個，結果獲得了與目標基因連鎖的AFLP標記1個，并將它轉化成了STS標記，其與Rfo基因遺傳距離為1．2cM[20]。汪志偉通過構建F2群體，采用BSA法篩選了100條RAPD引物發現標記OPC06-1900與Rfo基因連鎖，遺傳圖距為11．6cM，然后通過進一步研究將標記OPC06-1900成功轉換，獲得了兩個顯性的SCAR標記SCC06-1894和SCC06-415，與Rfo基因的遺傳圖距為8．0cM[21]。通過構建BC1群體，鄭晨光采用BSA法篩選了500個RAPD標記引物，其中標記S1344和S88與Rfo基因連鎖，其遺傳圖距分別為4．2cM和6．9cM，這兩個標記之間的遺傳圖距為9．1cM，并且分布在Rfo基因的兩側，可用于對Rfo基因的MAS育種[22]。這些分子標記的獲得能夠促進ogu CMS恢復系的轉育，提高了ogu CMS的應用價值及范圍。

3 其他CMS恢復基因的分子標記研究

Heike Trendelkamp等對11個AFLP標記進行了分析，獲得了一個18．3cM的Tour CMS連鎖圖譜[23]。Janeja H S等對64個AFLP標記進行了研究，篩選出2個與恢復基因連鎖的標記，其中EACC/MCTT105與RFt1的遺傳圖距為18．1cM，與RFt2的遺傳圖距為33．2cM，另一標記EAAG/MCTC80位 于 RFt1另一側，與 之 相 距亦是 18．1cM，為利用MAS技術研究Tour CMS恢復系打下了基礎[24]。程計華等通過構建F2分離群體，獲得了一個與Nsa CMS恢復基因緊密連鎖的AFLP標記，與恢復基因的遺傳距離在2．0cM左右[3]。接著，又獲得了一個AFLP標記EM107，其與恢復基因間的交換率在6．7%左右[25]。孫盼盼對180對AFLP標記引物進行分析，從中找到多態性AFLP標記17對；對94條RAPD標記引物進行分析，從中找到多態性RAPD標記10個，對96對SSR標記引物進行分析，從中找到多態性SSR標記2對；對170對SRAP標記引物進行分析，從中找到多態性標記引物30對，然后利用F2群體單株驗證后發現了4個SRAP標記與Nsa CMS恢復基因連鎖[26]。Hu Qiong等根據PPR基因的保守序列設計了特異性引物進行分析，開發了一個與Nsa CMS恢復基因緊密連鎖的標記[27]。這些分子標記的開發加快了新胞質雄性不育系在油菜育種中的應用，對于油菜雜交育種的可持續性發展十分有利。

4 展望

隨著生物技術以及測序技術的發展，越來越多的分子標記被開發和應用。油菜是主要油料作物，選育強優勢雜交種和提高油菜的產量和品質一直是育種家的育種目標。常規的油菜CMS育種需要大量的測交，選育恢復系，耗時較長，工作量較大，而對恢復基因進行分子標記研究可以獲得與恢復基因緊密連鎖或共分離的分子標記。分子標記較穩定，不易受環境影響，能對基因型進行直接篩選。利用這些連鎖的分析標記可以快而準確地篩選具有恢復基因的材料，從而選育出恢復系，可有效縮短育種進程。尤其對于恢復源較窄的異源胞質雄性不育恢復系的選育是非常實用的，可以幫助育種家在大量的種質資源的中快而準地發現恢復源材料，提高不育系的應用價值。

分子標記輔助育種技術雖然有很多優勢，但是它的準確性依賴于實驗條件、實驗技術手段、實驗材料等因素。因此，為了獲得精準的結果，建議將常規育種手段與分子育種技術相結合，相互驗證。通過連鎖標記發現恢復源材料后，還是需要做測交試驗，最終通過觀察測交后確認篩選的材料是否真的具有較強的恢復能力以及配合力。相信隨著現代分子生物學、油菜基因組測序的完成以及常規育種技術的提高，各類分子標記的開發越來越方便，其檢測手段也將逐步改善，與常規育種技術結合更成熟，將會更有效地用于油菜的雜交育種，從而加快推進油菜育種的進程。