肺癌類器官的研究進展

賈梓淇，王艷宇，王亞東，邴鐘興，梁乃新*，李單青*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 胸外科，北京 100730； 2.北京協和醫學院 八年制臨床醫學專業，北京 100005)

肺癌(lung cancer)是目前全世界發病率和病死率最高的惡性腫瘤，盡管亞洲人群中有25%左右的肺腺癌攜帶意義明確且可治的驅動基因突變，但絕大多數晚期肺癌仍屬難治性。目前針對這一群體尚無明確的精準治療方案，故腫瘤體外功能學模型成為目前針對難治性肺癌探究腫瘤藥物敏感性的研究熱點。其中，類器官(organoid)是一種從干細胞增殖而來且微觀下具有自組裝特性的三維體外腫瘤模型，其囊括了原始腫瘤的結構和功能特征，并具有時效快、 增殖能力強、 可操縱性好等優點， 可以用于研

究瘤內多細胞間相互作用、原始腫瘤的發生發展和藥物敏感性。目前肺癌類器官已經可以從多種不同病理類型的肺癌原始腫瘤成功培養，并具有一定的基因可操作性。越來越多的證據表明類器官可以用于精準預測實體瘤患者體內腫瘤的藥物敏感性，未來或可用于肺癌全程管理中的精準治療方案選擇。本文將從歷史發展和基礎-臨床轉化應用方面對肺癌類器官進展進行綜述。

1 腫瘤類器官概述

患者腫瘤組織培養的類器官(patient-derived organoid，PDO)是取材自患者的穿刺、手術標本、循環腫瘤細胞、胸水或肺泡灌洗液等經過體外培養得到的有增殖和空間自組織能力的三維多細胞團[1]。其形成有賴于標本中有增殖分化能力的腫瘤細胞、組織中的干細胞和經誘導分化的多能細胞。PDO培養成功率較高，約為50%～80%[2]，為利用患者腫瘤標本建立大型生物標本庫提供了機會。多類腫瘤目前已可構建PDO，且成功培養的PDO在組織結構[2]、基因組[3]、轉錄組以及功能上都與原始腫瘤組織高度相似，能夠很好地濃縮原始腫瘤的主要特征。目前，腫瘤類器官的培養是在含有細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的Matrigel三維(three dimension，3D)膠中添加含Wnt、R-spondin1、EGF和Noggin等[1-2]生長因子的培養基來完成，不同種類的腫瘤培養基成分略有不同，而最終形成的三維多細胞團可以在96孔板或384孔板上進行藥敏檢測。目前有越來越多的證據表明，PDO的藥敏結果可以用于臨床指導患者體內腫瘤的精準治療。

2 肺癌研究中的功能學模型

目前已有的腫瘤研究模型分為體內(invivo)和體外(invitro)兩類。體外模型包括腫瘤細胞系(patient-derived cell line，PDCL)、腫瘤細胞原代培養和類器官模型；體內模型包括基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse model，GEMM)、細胞系來源的異種移植瘤模型(cell-line derived xenograft，CDX)和患者腫瘤來源異種移植瘤模型(patient-derived xenograft，PDX)等。其中PDCL具有易于培養、增殖迅速、費效比低等諸多優點，故PDCL是目前應用最為廣泛的腫瘤模型。但PDCL同時存在丟失原始腫瘤內部異質性、對腫瘤的分子生物學和生理特點描述差等缺點。而腫瘤細胞原代培養在這些方面略有優勢，但培養條件復雜，培養周期長(約6個月)，在時效性上難以用于腫瘤患者的臨床選藥[4]。同時，無論是PDCL還是腫瘤細胞原代培養都無法描述腫瘤微環境，而目前已知腫瘤微環境中的成纖維細胞及其分泌的生長因子會影響腫瘤細胞對靶向藥物的敏感性和耐藥性。相比之下，GEMM和PDX可以在小鼠體內提供腫瘤微環境，但小鼠和人類腫瘤微環境的一致性仍需探究。而且，小鼠模型構建成功率低、價格高、時間長，故亦難以實際應用于高通量藥物篩選和臨床患者焦急的選藥場景[5]。因此就綜合培養成功率、時效性、費用及對腫瘤藥敏描述的準確性而論，混合細胞培養得到的類器官優于其他模型[4]。相比于PDCL，PDO和PDX二者則具備可以模擬腫瘤組織學特征且腫瘤的基因組及表達組異質性保存良好的特征，是目前實驗室研究腫瘤生物學特性和藥物敏感性的重要模型，尤其是PDX可以用于驗證在PDO中發現的腫瘤的藥敏特性。目前認為，PDO可以保留絕大多數原始腫瘤的主克隆，同時，在結直腸癌和卵巢癌的研究中證實，類器官在大量擴增之后發生遺傳突變的概率很小，傳代穩定性較高[6]，但是能否高度還原原始腫瘤內部的異質性尚待研究。為更好地模擬腫瘤的生物學環境，PDO與血管生成間充質干細胞及免疫細胞的共培養體系也在研究進程中[7]。

因此，PDO具有匯集原始腫瘤特征、可操作性強、增殖較快、穩定性較高、可高流量篩選、可建庫保存等優點。盡管腫瘤類器官的臨床應用仍需大規模臨床隨機對照試驗的探索，但結合以上優點，PDO在精準醫學治療癌癥的臨床前用藥決策中有著巨大的價值潛力。

3 肺癌類器官模型構建的研究進展

肺癌類器官的探索經過了原代腫瘤細胞培養、腫瘤細胞間質細胞混合培養(2D-類器官)[4]、肺癌類器官3個階段的探索。培養標本來源也從手術及穿刺標本進而發展到可以通過循環腫瘤細胞[8]、胸水或支氣管肺泡灌洗液培養。近年來，尸檢材料也已被用于成功建立PDX和PDO，這對于確定導致患者死亡的腫瘤最終狀態以及探究腫瘤的進化和異質性非常重要。尸檢材料的研究還可以對常規手段無法獲得的原發性和多發轉移性病灶進行分子分析，并通過類器官研究其不同的藥物敏感性。同時，通過尸檢獲得大標本可以協助研究腫瘤微環境中的基質成分，這些成分可能是腫瘤進展的重要驅動因素。

實體瘤類器官的培養相對于血液系統惡性腫瘤來說成功率較低。對于肺癌而言，穿刺標本和血液標本中的腫瘤細胞數量稀少、間質細胞數量多，手術標本同樣有間質細胞混雜，且面臨組織消化過程對細胞的損傷，故實體瘤的類器官培養難度較大。

實現肺癌類器官培養經歷了多種培養方式，包括促人多能干細胞分化[9]、調控原代細胞和肺癌細胞轉化[10]以及通過“條件重編程”方法增加對腫瘤活檢物培養的成功性[11]等。有干性的細胞可以通過熒光激活細胞分選系統或磁珠抗體細胞分選系統進行分離，并在2D培養基或含有Matrigel的3D培養基中進行進一步培養[5]。目前，氣管纖毛上皮類器官可以在數周內從小鼠和人類氣管和上支氣管分離出的基底細胞成功培養構建，同時可以對類器官的正常和組織修復狀態分別進行分子生物學分析。由干細胞培養出含有2型呼吸上皮(alveolar type 2 cells/type 2 alveolar epithelial cell，AT2 / AEC2)肺泡樣類器官過程中需不含有基底細胞，而研究發現通過共培養表面活性蛋白C(surfactant protein C, SFTPC)陽性的AT2/AEC2干細胞和表達PDGF受體α的基質成纖維細胞有利于培養出不含基底細胞的類器官。在類器官中尚未能重現在譜系標記肺模型損傷后出現的1型呼吸上皮(alveolar type 1 cells/type 1 alveolar epithelial cell，AT1 / AEC1)祖細胞重建和AT2 / AEC2細胞擴增現象，提示這一過程可能需要某些特殊的生長因子，或需要共培養AT1 / AEC1和AT2 / AEC2祖細胞來完成[5]。誘導多能干細胞的方法則多用于形成同時具有上皮和間質成分的肺類器官，以用于構建肺的器官發育和疾病模型，并用于探究多種生長因子信號通路[5]。這些通過多能干細胞形成的類器官可用于在3D情況下研究上皮和間質細胞的相互作用以及研究微環境中的獨立細胞[12]。

構建具有腺癌、鱗癌和神經內分泌腫瘤特征的肺癌類器官可以通過在培養基中添加促分裂原，如配體激活劑神經調節蛋白(neuregulin)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)-酪氨酸激酶受體3(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB3)或酪氨酸激酶受體2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB2)-ERBB3異二聚體來完成[13]。充分解決了肺癌分類多，治療方式不同的研究難題。

正常組織肺類器官可以用于構建肺癌發生模型，即通過感染原癌基因過表達互補DNA(cDNA)或shRNA(short hairpin RNA)等基因表達調控技術，在器官發育關鍵點誘發細胞異常增殖。利用該模型已先后證明了β-連環蛋白(β-catenin)和Wnt信號通路在維持肺祖細胞增殖穩定性中的關鍵作用[14]，以及SOX2(SRY-like HMG box 2)基因和Notch通路對KRAS(KRAS proto-oncogene)基因突變2型呼吸上皮細胞腺癌發生的影響[15]。通過該方法構建的KRAS突變肺癌類器官可用于評估多種絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)抑制劑的療效，并與化療藥物和EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)對比，進行中通量單藥及聯合用藥篩選[16]。肺類器官也已被用于研究與肺癌發生發展相關的炎性反應和組織損傷反應，包括對肺纖維化[17]、博萊霉素誘導的組織損傷的反應與上皮增殖狀態相關性[18]等。

4 肺癌類器官的臨床應用

類器官作為功能學模型可以在以下場景中應用于臨床：

第一，進行腫瘤藥物敏感性檢測。腫瘤細胞原代培養是最早以患者原始腫瘤直接構建的藥物敏感性體外實驗模型，用于EGFR TKI和ALK TKI耐藥機制的探究[19]。相比于原代培養，肺癌PDO是腫瘤細胞和基質細胞的混合多細胞團，可以一定程度綜合微環境中的成纖維細胞對藥物敏感性的影響。目前有多項研究利用小鼠移植瘤模型驗證了PDO與PDX的藥敏一致性，并有病例報道驗證了PDO挑選的化療、靶向藥物在患者體內對原始腫瘤有效[13, 20]。隨著免疫治療的不斷發展，成纖維細胞和免疫細胞的類器官共培養成為了解癌癥及其腫瘤微環境之間免疫相互作用的新方法，并將用于肺癌免疫治療療效的研究。而肺類器官用于炎性反應機制的研究已發現抗白介素-6(interleukin-6，IL-6)聯合順鉑作為IL-6+肺癌的潛在聯合用藥方案[21]。

第二，高通量藥物敏感性篩選。PDO的藥物敏感性篩選可以通過在96孔[22]和384孔[23]板中實時觀察其增殖和死亡情況[22]，同時對上百種藥物進行藥物敏感性的篩查。故其在藥敏檢測上更為高效。

第三，臨床試驗。肺癌類器官的臨床應用尚待臨床試驗證實其有效性，目前歐洲有兩項隨機對照試驗正在進行，分別對晚期肺癌的標準治療能否在類器官中驗證療效(TUMOROID, NL49002.031.14)以及借助肺癌類器官進行終線選藥的療效(SENSOR, NL50400.031.14)進行研究。

5 肺癌類器官的局限性及展望

肺癌發病率高且其患者預期壽命有限，臨床上亟需可改善其預后的轉化研究，故針對肺癌的功能學臨床前模型的研究十分重要。盡管類器官模型研究正高歌猛進，但其臨床應用仍受到如下制約：1)類器官培養的開銷較高；2)類器官與原始腫瘤的一致性反映的是原始腫瘤的主克隆還是部分亞克隆仍待研究；3)類器官藥物敏感性指標的解讀仍需研究，不同作用機制的藥物藥敏結果如何比較尚無定論；4)類器官培養成功率仍需提高，若希望將類器官技術應用于一線選藥，其培養所需時間仍需縮短。類器官雖然在諸多方面體現出優勢，但由于各個模型的適用場景各異，在進行實驗室研究前，權衡利弊選擇合適的腫瘤功能學模型顯得尤為重要。

而類器官作為對原始腫瘤模擬性好、易于擴增保存并能用于高通量藥敏篩選的臨床前模型成為目前肺癌轉化醫學中的研究熱點。肺癌類器官可以用于構建腫瘤發生模型、研究病因學機制、轉移線索、藥敏篩選，并通過與其他細胞共培養研究腫瘤微環境，最終將會作為肺癌的個性化精準治療的補充與現有的多組學精準醫學決策體系相互補充。