糖原合成酶激酶3β參與神經病理性疼痛的研究進展

李安然，連麗麗，姚 剛

(吉林大學第二醫(yī)院神經內科，吉林 長春 130041)

神經病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是指軀體感覺系統(tǒng)的損害或疾病導致的疼痛，分為周圍性神經病理性疼痛和中樞性神經病理性疼痛2種類型，表現為自發(fā)性的感覺過敏、痛覺超敏或異位痛。其臨床表現復雜多樣，病程長，多數患者病程超過3個月，常常原發(fā)致痛病因已經消除或控制，疼痛仍長期存留，嚴重影響患者的工作、學習和生活[1]。外傷、神經壓迫、感染、中毒、營養(yǎng)障礙、代謝紊亂、免疫、遺傳、血管病變和腫瘤等多種因素均可引起神經損害，常見的病因包括帶狀皰疹感染、糖尿病、腫瘤壓迫或浸潤、化療和放療、慢性酒精中毒、梅毒或人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、腦卒中、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、創(chuàng)傷和術后神經損傷等[2]。NP發(fā)病涉及多種機制，包括外周敏化、中樞敏化、膠質細胞激活、離子通道改變和炎癥反應等[3]。NP治療主要采用鈣離子通道調節(jié)劑(加巴噴丁和普瑞巴林等)、鈉離子通道阻斷劑(卡馬西平和奧卡西平)、三環(huán)類抗抑郁藥、血清素-去腎上腺素再攝取抑制劑、阿片類藥物、神經調控技術、微創(chuàng)治療和射頻治療等，但總體治療效果仍不理想，慢性NP患者常伴隨失眠、焦慮、抑郁甚至殘疾，導致患者生活質量嚴重下降[3]。

糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，參與細胞內多種重要生理功能，如細胞分化、增殖和凋亡等。GSK-3包括GSK-3α和GSK-3β 2種亞型，其中GSK-3β是細胞內多條重要信號通路的關鍵分子，腫瘤、糖尿病、神經退行性疾病和炎癥等均與GSK-3β調節(jié)異常存在關聯，GSK-3β抑制劑也被用于上述疾病的治療。近年來，對炎癥反應在NP病理過程中發(fā)揮作用的研究越來越多，促炎因子或介質在NP的發(fā)生和維持中起著重要的作用。有研究[4]顯示：GSK-3β可以通過干預促炎因子與抗炎介質之間的平衡來參與NP的發(fā)生發(fā)展；基礎實驗[5]證實：應用GSK-3β抑制劑能夠減輕模型動物的痛覺過敏，同時顯著改善其疼痛癥狀。GSK-3β與NP的相關性研究為深入探討NP發(fā)生機制、尋找新的治療靶點提供了思路和方向。

1 GSK-3的生物學特性

GSK-3于1980年由兔的骨骼肌中首次提取純化出來，是絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白(mitogen activated protein，MAP)激酶家族。GSK-3在哺乳動物中有GSK-3α和GSK-3β 2種亞型，分別由3和19號染色體編碼，相對分子質量為51 000和47 000，二者整體氨基酸序列同源性為85%，中央激酶區(qū)域同源性高達98%[6]。盡管有高度的相似性和功能重疊，但2種亞型不可相互替代，敲除GSK-3α基因的小鼠尚可存活，GSK-3β功能的喪失或突變對于胚胎或新生小鼠是致命的[7]。GSK-3廣泛分布于人體組織，在神經系統(tǒng)中，GSK-3α主要分布于海馬、大腦皮層、紋狀體和小腦，GSK-3β在大腦所有部位均有分布，主要表達于神經元及膠質細胞[8]。盡管GSK-3α和GSK-3β均參與神經功能調節(jié)，但大多數研究集中于GSK-3β亞型[9]。

GSK-3活性受到精細調節(jié)，涉及磷酸化、亞細胞定位以及與GSK-3結合蛋白之間的相互作用，其中GSK-3磷酸化是研究最多的調節(jié)方式。GSK-3β的負性調節(jié)因子是第9位絲氨酸(Serine)，該位點磷酸化后GSK-3β活性受到抑制；其正性調節(jié)因子是第216位酪氨酸(Tyrosine)，該位點磷酸化后GSK-3β活性得到增強[10]。GSK-3也能夠使多種底物發(fā)生磷酸化，包括細胞結構蛋白、轉錄因子和細胞分裂起始因子等，在蛋白質合成、信號傳遞、細胞增殖與分化、神經功能和腫瘤形成等多種細胞生理活動中扮演重要角色[11]。

GSK-3作為一種下游調節(jié)開關，決定著多種信號通路在接受不同信號刺激后的反應和信息產出，其中經典通路包括：①Wnt-β-連環(huán)蛋白(Wnt-β-catenin)信號通路。GSK-3β在Wnt信號通路扮演重要角色，參與組成泛素蛋白酶，分解β-catenin使其保持在較低水平；當GSK-3β被抑制時，β-catenin在細胞質中堆積并進入細胞核，與轉錄因子結合啟動下游靶基因的轉錄。GSK-3β可以通過該通路調節(jié)細胞的增殖、分化、運動和凋亡等過程，還在胚胎發(fā)育及成熟組織內穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用，該通路異常會導致細胞增殖失調控和腫瘤的發(fā)生[11]。②磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidlylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)-GSK-3β信號通路。GSK-3β是最早發(fā)現的AKT的直接底物，二者結合后GSK-3β失活，導致轉錄因子、cAMP反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)、信號轉導和轉錄激活因子1激活，進而影響核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和tau蛋白等下游底物的生物活性[12-13]。③猬因子(Hedgehog)信號通路。在胚胎發(fā)育過程中，Hedgehog和Wnt信號通路協同作用，指導細胞增殖分化，GSK-3β參與Hedgehog信號通路主要是通過磷酸化GLI家族鋅指蛋白(GLI family zincnger，GLI)，降解GLI 1和GLI 2，還可以水解GLI3形成抑制因子，使GLI蛋白轉移到細胞核，激活Hedgehog信號靶基因的轉錄[14]。此外GSK-3β還可以通過調控微管動力學參與神經元的發(fā)育及軸突延長等。總之，GSK-3β是一種高度保守、多功能化的蛋白質，是調控多種細胞過程所必需的。

2 GSK-3β參與炎癥反應

GSK-3β參與20多種轉錄因子活性的調控，其中包括與炎癥有密切關聯的NF-κB、CREB和轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)等。GSK-3β通過一系列生化反應最終調控炎癥介質的表達，使炎癥因子及趨化因子的生成增加，抗炎因子的生成減少。通路在調節(jié)宿主炎癥反應過程發(fā)揮重要作用，炎癥反應過程中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作用于Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)，激活PI3K，促進腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和白細胞介素12(interleukin-12，IL-12)等炎癥因子和介質的產生，GSK-3β作為PI3K通路的下游激酶，可以選擇性地調節(jié)LPS對TLR的激活，參與促炎因子與抗炎因子的平衡調節(jié)。2005年，MARTIN等[15]首次證實上述論點，此后該作用在外周單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞中得到證實[16]。研究者[15-17]還發(fā)現：在肝細胞中抑制GSK-3β，可以在不影響NF-κB的降解及核轉位的情況下抑制NF-κB介導的轉錄，從而大大減少TNF-α、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)等促炎因子的產生。在膿毒癥中，GSK-3β也 可以通過活化STAT3，刺激膠質細胞產生IL-6，參與炎性損傷[18]。

白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)是一種主要的抗炎因子，可以抑制環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX2)、IL-1β和白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)的表達，對于感染和炎癥的穩(wěn)態(tài)控制是必不可少的，而GSK-3β可以通過PI3K/AKT/GSK-3通路減少CREB核轉位，進而抑制IL-10的表達[19]。在神經源性炎癥中，星型膠質細胞和小膠質細胞中的GSK-3β被證實可以促進多種趨化因子的產生[20]。急性或慢性束縛應激研究[21]顯示：嚙齒動物額葉皮層Toll樣受體4(Toll-like receptors-4，TLR4 )mRNA表達水平升高，進而使趨化因子CCL3、CCL4和CCL5的表達水平較正常增加20%以上，同時誘發(fā)TLR4信號下游的轉錄因子NF-κB的活化，進而誘導多種細胞因子和趨化因子的產生，而這一過程同樣離不開GSK-3β的活化。

前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)同樣參與炎癥反應的調節(jié)，一方面其可以抑制促炎因子(TNF-α和IL-6)及趨化因子(CCL3和CCL4)等的產生，另一方面可以促進抗炎因子IL-10的合成，此外還可以影響T細胞向輔助型T淋巴細胞2(T helper 2 cell，Th2)的分化，而應用GSK-3抑制劑可以促進PGE2的產生[22-23]。在體外實驗中，GSK-3β抑制劑可以使IL-6和一氧化氮(NO)的產生減少70%和80%，并上調CD116(小膠質細胞活化的一種標志物)和誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達，GSK-3β可以選擇性地促進LPS刺激后的iNOS表達，使NO生成增加[20，24]。GSK-3β還可以通過對IFN-γ的下游信號通路兩面神激酶/信號轉導及轉錄激活因子(janus kinase/signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)進行調控，參與IFN-γ對炎癥調控的協同作用。

3 GSK-3β參與NP的病理過程

近年研究[9]表明：GSK-3β能夠介導炎癥通路并參與痛覺調制，抑制GSK-3β活性有利于減輕炎癥和緩解疼痛。部分坐骨神經結扎(partial sciatic nerve ligation, pSNL)誘導的NP動物模型中，在第2～10 天觀察到模型大鼠產生熱痛覺過敏，第6～10天產生機械痛覺過敏，GSK-3β的活性測定顯示其在第10天明顯升高，應用GSK-3β抑制劑處理后第8～10天大鼠熱痛覺過敏得到改善，第6～10天機械痛覺過敏也相應減輕，該實驗首次證實GSK-3β可以激活脊髓背角星形膠質細胞參與熱痛覺過敏和機械性異常疼痛[25]。短暫的瑞芬太尼接觸可以提高疼痛敏感性，采用瑞芬太尼誘導的大鼠切口痛覺過敏模型，于給藥前1 d和給藥后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d進行機械和熱痛實驗，檢測脊髓后角α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3 -hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR)亞基(glur1和glur2)轉運、AMPAR磷酸化狀態(tài)和GSK-3β活性，并采用全細胞膜片鉗記錄分析了GSK-3β抑制對脊髓背角AMPAR誘導電流的影響，結果表明：GSK-3β調節(jié)脊髓背角AMPAR的表達，抑制GSK-3β的活性可以明顯減輕芬太尼引起的痛覺過敏[26]。在慢性坐骨神經壓迫損傷(CCI)大鼠模型[27]中，磷酸化GSK-3β(pGSK-3β)(Tyr216)有長期增強趨勢，pGSK-3β(Ser9)降低，而GSK-3β蛋白水平幾乎不變，這是由于CCI模型大鼠脊髓中C-X-C族趨化因子5/C-X-C族趨化因子受體2(C-X-C motif chemokine 5/C-X-C chemokine receptor 2, CXCL5/CXCR2)上調并活化GSK-3β所致；鞘內CXCL5的釋放可呈劑量依賴性地引起和維持高痛覺，而應用GSK-3β抑制劑可以預防該情況的發(fā)生。在瑞芬太尼誘導的NP小鼠模型中，GSK-3β mRNA和蛋白表達水平增加，pGSK-3β(Ser9)表達水平明顯降低[28]。

紫杉醇為常用的癌癥化療一線藥物，但長期使用往往引起感覺障礙及神經病理性疼痛。研究[28-29]顯示：大鼠注射紫杉醇后的第10和20天，模型大鼠脊髓背角GSK-3β的活性增加，蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)則在相同區(qū)域和時間點的活性降低，同時伴隨脊髓背角膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和IL-1β蛋白表達水平升高，谷氨酸轉運體 1(glutamate transporter-1，GLT-1)蛋白表達水平下調；當大鼠預先接受鋰(GSK-3β抑制劑)治療時，以上生物標志物的變化基本被阻止，并且在第1次紫杉醇注射后的第11天逆轉機械和熱性異常疼痛，與此同時，GSK-3β活性增加、脊髓背角AKT和mTOR活性的降低也均被逆轉，GLT-1、GFAP和IL-1β的蛋白表達隨之改變，證明抑制脊髓GSK-3β活性是減輕紫杉醇誘導的NP的關鍵機制，同時也是改善脊髓GLT-1表達及抑制膠質細胞活化和IL-1β過量產生的有效方法。MARTINS等[30]應用醋酸和甲醛誘導小鼠傷害性感受，結果顯示：GSK-3β抑制劑AR-A014418和NP031115均可以衰減模型小鼠的痛覺反應，提示GSK-3β參與痛覺調制，GSK-3β抑制劑具有鎮(zhèn)痛作用。另有研究[31]顯示：腹腔注射AR-A014418能夠明顯改善坐骨神經損傷模型小鼠的機械性痛覺過敏，其機制與調節(jié)血清素和兒茶酚胺途徑、抑制促炎因子釋放有關。GSK-3β能夠調控CREB和NF-κB的核轉位，從而調節(jié)促炎因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)和抗炎因子(IL-10)的平衡，在疼痛的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[15]。

4 GSK-3β參與NP的機制

NP的發(fā)病機制復雜，包括中樞敏化、周圍敏化、膠質細胞激活和炎癥反應等[32-33]。中樞敏化被認為是NP發(fā)生發(fā)展最基本也是最關鍵的機制，可以導致痛覺感受神經元突觸傳遞增強和興奮性異常升高，使神經元自發(fā)性放電增多、感受域擴大，外界刺激閾值降低、閾上刺激反應增強，放大疼痛信號的傳遞。周圍敏化指的是長期慢性損傷導致周圍神經放電、傳導和神經遞質改變以及炎癥反應的發(fā)生，使得外周神經對疼痛刺激感覺過敏，并將信號上傳至中樞，其中神經炎癥是外周敏化形成的關鍵。

膠質細胞(星型膠質細胞和小膠質細胞)作為神經系統(tǒng)的主要免疫細胞，其生物活性的激活以及隨后釋放的促炎細胞因子在NP的發(fā)生和維持過程中同樣具有關鍵作用[34]，在幾乎所有的NP動物模型中，小膠質細胞和星形膠質細胞均被激活[35]。正常大鼠鞘內注射IL-1β和TNF-α可增強背角神經元的急性反應和終末活動，以及機械性痛覺異常和痛覺過敏[36]。抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的活化，可以減少體內細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，從而減輕神經損傷引起的痛覺過敏；同樣，用IL-1β、IL-6和TNF-α拮抗劑治療可降低炎癥、神經損傷和嗎啡耐受引起的超敏反應[37]。除了釋放促炎細胞因子外，研究者[38]還發(fā)現：星形膠質細胞的激活與膠質細胞谷氨酸轉運體(glutamate transporter，GLT)的功能障礙有關。脊髓背角膠質細胞GLT蛋白的下調有助于多種病理性疼痛的發(fā)生，包括神經損傷引起的神經性疼痛、化療和嗎啡耐受[39]。

研究[16,25,40-41]表明：GSK-3β可以通過促進外周敏化、中樞敏化和膠質細胞活化等多種機制參與NP的發(fā)生發(fā)展。GSK-3β能夠激活巨噬細胞和單核細胞等炎癥細胞釋放促炎因子(TNF-α、IL-6和IL-1β等)、趨化因子及其他炎癥相關介質[16]，上述介質直接或間接作用于外周傷害性感受神經元，通過上調傳導神經元的興奮性、改變離子通道，或者直接引起神經元痛覺過敏，導致外周敏化[40]。研究[25]顯示：GSK-3β可以促進小膠質細胞增殖、遷移以及產生炎癥因子，誘導炎癥引起的神經毒性，應用GSK-3β抑制劑可以減少小膠質細胞的遷移和促炎反應。應用GSK-3β抑制劑還可以減少星型膠質細胞活化標志物GFAP的表達，提示GSK-3β也參與了星型膠質細胞的活化[41]。

脊髓谷氨酸受體的過度激活是脊髓背角神經元異常活動主要原因，其主要受3個因素的影響：突觸釋放谷氨酸的量、GLT清除谷氨酸的速率和突觸后谷氨酸受體的活性。而GLT-1是中樞神經系統(tǒng)中主要的谷氨酸轉運體，GSK-3活性增強使得GLT-1下調，谷氨酸堆積，誘導機械痛和熱痛覺；也可以增加谷氨酸的再攝取進而增加谷氨酸的釋放量，由此產生中樞敏化[25]。N-甲基-D-天冬氨酸(n-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受體在突觸可塑性和慢性疼痛形成中起重要作用[42]。GSK-3β可以促使NMDA受體中的NR1和NR2B亞基從細胞內到細胞表面的轉移增加，加強NMDA受體介導的轉運功能，NMDA轉導活性增強，細胞內鈣離子數量增加，微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC)的幅度及頻率增加，神經元興奮性增加，誘發(fā)中樞敏化[13]。在中樞神經系統(tǒng)中，痛覺傳導系統(tǒng)的興奮和抑制一直保持著平衡，除了傳導神經元的興奮性增強可以導致中樞敏化外，抑制作用的減弱同樣也會引起中樞敏化。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經系統(tǒng)中的主要抑制性神經遞質，由抑制性神經元釋放，通過作用位于痛覺傳導纖維的受體參與疼痛抑制。機體通過谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)合成GABA，而GSK-3β可以抑制谷氨酸的轉運，從而使得神經膠質細胞谷氨酸攝取不足，導致GABA能神經突觸強度降低而使其抑制作用下降，非傷害性刺激即可引起機體產生疼痛，誘發(fā)中樞敏化[43]。

5 展 望

神經炎癥是許多神經系統(tǒng)疾病的共同病理生理特征，如阿爾茨海默病、艾滋病伴發(fā)的癡呆、多發(fā)性硬化和精神分裂癥等，GSK-3活性改變或調節(jié)異常在其發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用，抑制GSK-3β活性的藥物可以改善上述疾病的癥狀[44-45]。GSK-3β與疼痛的關系是近年來研究的一個新的熱點，越來越多的研究證明GSK-3β與NP有著密切的聯系。GSK-3β通過介導炎癥通路、膠質細胞活化和神經遞質改變等參與NP發(fā)生的神經敏化。GSK-3β抑制劑對不同NP動物模型的熱痛覺過敏和機械性異常疼痛等均有明顯的改善作用，提示GSK-3β及其相關通路是NP發(fā)生和維持的關鍵步驟，未來需要進一步研究調節(jié)GSK-3β活性的上游通路和GSK-3β影響脊髓感覺調控的下游信號通路，為探討NP的發(fā)病機制和鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)提供新的思路。