試紙型生物傳感器檢測病原微生物的研究進展*

胡柳楊，韓 冰 綜述,曹東林 審校

廣東省第二人民醫院檢驗醫學部，廣東廣州 510317

當今感染性疾病仍是引起人類死亡的主要原因，開展病原微生物的現場快速檢測對疾病的治療和預后尤為重要。目前，臨床上主要使用的呼吸道病原體檢測方法包括顯微鏡檢查、細菌培養和免疫學試驗，這些方法操作過程煩瑣，耗時長，具有一定技術難度，靈敏度較低。隨著分子生物學技術的飛速發展，DNA G+C mol%測定、特異探針雜交技術、PCR技術擴增特異核酸片段、16SrRNA序列分析、限制性片段長度多態性分析及生物芯片等技術被應用于病原微生物檢測，這些方法的靈敏度和特異度高，并且能做到快速檢測，但都依賴于昂貴的儀器設備及經過培訓的實驗室技術人員，這使其在小型社區醫院及偏遠地區的應用受到限制。生物傳感器技術是近年來發展迅速的病原微生物檢測方法，具有快速、靈敏、成本低、易于自動化的優點，用于病原體檢測的主要有免疫傳感器和DNA生物傳感器[1]。其中DNA生物傳感器可以特異性地識別病原微生物的特異核酸序列，已受到越來越多的關注。DNA生物傳感器的一般原理包括將DNA探針固定在傳感器表面，通過電化學[2]、光學[3]或重量法[4]進行雜交和檢測。越來越多的DNA生物傳感器被設計用于病原微生物的即時診斷，試紙型生物傳感器——基于紙張的微流體生物測定幾乎符合即時診斷設備的所有關鍵標準[5]，即不需要復雜的設備、試劑或電源，靈敏且準確測定，并且檢測快速、成本低，易于使用和運輸。本文闡述了試紙型生物傳感器的工作原理、應用研究和最新進展，并探討其在病原微生物現場快速檢測中所面臨的挑戰和發展趨勢。

1 試紙型生物傳感器的原理

1.1試紙型免疫生物傳感器 試紙型免疫生物傳感器[6]的試紙條依次由樣品墊、綴合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，硝酸纖維素膜和吸收墊以重疊方式附著在塑料背襯上，以促進毛細管流動。試紙型免疫生物傳感器各組成部分的作用分別為[6]：塑料背襯提供穩定性和黏合性；硝酸纖維素膜分別固定單克隆抗體和多克隆二抗，用于測試和對照；硝酸纖維素膜的一端是吸收墊，其與硝酸纖維素膜部分重疊，為毛細管流動提供驅動力；試紙條的最前端是樣品墊；在樣品施加端末放置綴合墊，由纖維素制成并用信號發生基團標記的特異性多克隆抗體處理。該生物傳感器由檢測線、對照線和控制線3部分組成，試紙條上的條帶顏色取決于信號發生基團的顏色。目前試紙型免疫生物傳感器多數以納米金粒子作為信號發生器，納米金粒子在520 nm處有等離子體共振峰，表現為特征性紅色。待測樣品在樣品墊被加載，然后經毛細管作用沿著條帶移動，并在最后的吸收墊處被收集，樣品移動到綴合墊時，待測物質與多克隆抗體結合形成待測物質-信號基團-多克隆抗體復合物，當樣品移動到測試區時，特異性的單克隆抗體捕獲待測物質-信號基團-多克隆抗體復合物，信號基團在檢測線中累積，呈現肉眼可見的條帶，條帶顏色的強弱與待測物質的含量呈正比。在測試區捕獲復合物后，未結合的成分(包括過量的信號基團-多克隆抗體)和流體部分繼續沿著條帶流動，通過多克隆二抗在對照區捕獲未結合的信號基團-多克隆抗體顯色?？刂凭€始終顯色，以保證試紙型生物傳感器的正常功能。

1.2試紙型DNA生物傳感器 試紙型DNA生物傳感器的試紙條組成與試紙型免疫生物傳感器大致相同，但不同于試紙型免疫生物傳感器，試紙型DNA生物傳感器的檢測不依賴于抗原-抗體的特異性結合。試紙型DNA生物傳感器將PCR與生物傳感器組合成一個系統，作為一種簡單快速的PCR后分析工具，與瓊脂糖凝膠電泳相比，靈敏度更高，并且檢測更加簡單和快速。試紙型DNA生物傳感器的一般原理包括將DNA探針固定在傳感器表面，通常將對捕獲DNA擴增子具有極強親和力的特定寡核苷酸序列或免疫物質(例如：半抗原-抗體和半抗原-蛋白質)作為DNA探針。目前大多數試紙型DNA生物傳感器通過使用金納米粒子[7-11]和有色聚苯乙烯微球[9]作為信號發生器來進行DNA的顯色檢測。試紙型DNA生物傳感器不僅可以定性檢測，還能進行半定量分析，定量數據可以通過儀器進行強度讀數或通過與酶[8]、熒光染料[12-13]或放射性偶聯物[14]的額外偶聯來記錄。試紙型DNA生物傳感器分為檢測區、對照區和控制區3個部分，傳感器表面的探針結合擴增的DNA，信號發生基團在檢測區累積，出現肉眼可見的條帶，當在低于飽和濃度的分析范圍內測試DNA產物的量時，強度與靶DNA的量呈正相關，從而提供了靶DNA的定量信息[7]。

2 試紙型生物傳感器的優點

試紙型生物傳感器的優點：(1)大部分DNA生物傳感器需要使用儀器，并且在大多數情況下，涉及幾個孵育和洗滌步驟。試紙型DNA生物傳感器不需要復雜的設備、試劑或電源，無須使用儀器即可直觀檢測DNA。此外，試紙型生物傳感器無須多次孵育和洗滌，并最大限度地降低對實驗室人員的要求。(2)具有良好的靈敏度和特異度。YETISEN等[5]證實試紙型DNA生物傳感器對PCR產物的檢測靈敏度是溴化乙啶電泳的50倍及以上，并且高于普通雜交。(3)試紙型生物傳感器可運行在多重反應系統上。試紙型免疫生物傳感器可以根據不同的需求在一個條帶上固定不同病原微生物的特異性抗體，實現病原體的多重檢測；試紙型DNA生物傳感器可以在一個條帶中檢測到多個擴增的靶基因DNA片段，不同探針分別用寡核苷酸或免疫物質(例如：半抗原-抗體和半抗原-蛋白質)標記，在臨床使用時，可根據不同需求，選擇特殊組合的探針，實現個體化核酸檢測。(4)檢測快速、體積小巧、一次性檢測、檢測成本低、易于使用和運輸。試紙型免疫生物傳感器無須對樣品進行任何預處理，樣品點樣后5 min內完成檢測[6]；試紙型DNA生物傳感器在PCR擴增后15 min內可得到結果[7-9]。這些特性使得它更適用于在檢驗設備缺乏的小型實驗室和需要快速檢測的現場進行即時檢測。

3 試紙型生物傳感器在微生物病原體檢測中的應用

試紙型生物傳感器平臺可根據不同需求進行相應的構建，可對不同的病原體進行多重、快速、準確、可視化檢測，在病原微生物及抗菌藥物耐藥分析中具有巨大的應用潛力。現將試紙型生物傳感器在病原微生物檢測中的應用總結如下。

3.1病毒性病原體的檢測 LILES等[15]應用試紙型生物傳感器檢測登革病毒并評估其檢測的靈敏度和特異度，該方法在檢測登革熱感染方面比Taqman RT-PCR更敏感，證實了這種方法也適用于使用反轉錄DNA模板檢測登革病毒。KOIWAI等[16]基于試紙型DNA生物傳感器建立了一種同時對3種常見的病毒(包括感染性肌壞死病毒、桃拉綜合征病毒和黃頭病毒)進行快速檢測的新方法，這3種病毒中的每種病毒均具有與常規PCR相同的靈敏度，且能產生更清晰的顯色結果并且能夠1次檢測3種病毒。試紙型DNA生物傳感器被應用于篩查、確定宮頸癌標本中是否存在人乳頭瘤病毒16型(HPV16)，測試結果與這些癌癥的表征匹配率為100%[14]。GLYNOU等[7]應用寡核苷酸功能化金納米粒子作為干試劑條帶生物傳感器中的探針用于DNA雜交分析，并檢測來自人血漿的丙型肝炎病毒RNA的RT-PCR產物，檢測效率比瓊脂糖凝膠電泳高8倍，該研究者發現條帶傳感器對靶DNA的檢測明顯更快，與瓊脂糖凝膠電泳和其他技術檢測所需的時間相比更短，僅需10 min。

3.2細菌性病原體的檢測 試紙型DNA生物傳感器被應用于檢測食源性病原體霍亂弧菌。在一項對174株霍亂弧菌和非霍亂弧菌進行臨床評估的研究中，與常規瓊脂糖凝膠電泳DNA檢測相比，試紙型DNA生物傳感器的靈敏度和特異度均為100%[9]，證明它是瓊脂糖凝膠電泳分析的可行替代品，易于使用，且能一次性使用，不需要任何專門的設備且無須使用致癌化學品。ANG等[10]建立了新型序列特異性核酸側向流動試紙型生物傳感器，用于檢測引起腹瀉的產毒性霍亂弧菌的霍亂毒素基因，并且在幾分鐘內得到快速的顯色結果，而無須在高溫下多次洗滌或孵育。KALOGIANNI等[11]建立了能同時檢測大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的雙色試紙型DNA生物傳感器，該傳感器能夠較為快速地實現對這兩種常見細菌的檢測。LI等[6]描述了能用于銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌特異性檢測的多重免疫傳感器的制造過程和測試結果。目前的即時檢測平臺都不能同時檢測多重細菌，但該試紙型免疫生物傳感器可用于快速檢測多重細菌的感染因子，對于每種測試的感染因子，傳感器都顯示出了高特異性和500～5 000 CFU/mL的檢測范圍。 HAYASHI等[17]用試紙型DNA生物傳感器實現了包括腸道沙門菌、志賀菌、腸侵襲性大腸埃希菌和腸出血性大腸埃希菌在內的4種食源性病原體的快速篩查，能夠幫助確認安全的食品進入市場。TIAN等[18]建立了能夠多重檢測口腔微生物群的試紙型DNA生物傳感器，實現了對口腔常見微生物的五重分析，并對其進行了半定量分析。接著，該研究者應用試紙型DNA生物傳感器多重分析了口腔斑塊中與齲齒相關的常見細菌的五元亞群[19]，表明該一次性試紙型DNA生物傳感器在分析口腔微生物組成以及微生物亞群的即時診斷方面具有巨大潛力。試紙型DNA生物傳感器可用于細菌性鼻竇炎相關細菌的檢測[20]，改進該傳感器對細菌性鼻竇炎和支氣管炎的診斷具有潛在價值。在過去30年中，細菌變異、抗菌藥物的不合理使用以及感染控制方面的問題，導致耐藥菌株的增加和播散，SHANMUGAKANI等[21]建立了一種能直接在糞便標本中多重檢測碳青霉烯酶基因的試紙型DNA生物傳感器平臺，能在2 h內直接在糞便標本中多重檢測blaNDM、blaKPC、blaIMP 和blaOXA-48等碳青霉烯酶基因。因此，試紙型DNA生物傳感器是可以應用于耐藥基因檢測的一種價格合理、快速的即時檢測工具。OHSHIRO等[22]開發了一種快速的試紙型PCR-DNA生物傳感器用于鑒定陽性血培養瓶中的金黃色葡萄球菌和抗菌藥物耐藥基因mecA和blaZ，整個過程可在1 h內完成。由于該方法與常規PCR方法相比，非?？焖俸秃啽?，并且與實時PCR或全自動裝置相比，更為經濟，證實其所提出的試紙型DNA生物傳感器技術可應用于快速診斷甚至應用于社區醫院等檢測儀器缺乏的地方。

4 試紙型生物傳感器技術的前景展望

試紙型生物傳感器技術平臺為臨床診斷中的多重分析及標本半定量分析提供了簡單、快速的檢測手段。由于試紙型生物傳感器小型化、便攜、檢測成本低、無須孵化和洗滌步驟、快速且靈敏度高、特異性強等優點，試紙型生物傳感器已被用于種植業[23]、水產業[16,24]、食品安全[17]、醫療衛生[18-19]等領域。

目前試紙型生物傳感器在病原體檢測方面的研究仍處于初期階段，國內相關研究相對較少，用于臨床檢測也有一定的局限性，主要包括：(1)試紙型生物傳感器測定細菌僅提供相對豐度，其不一定能反映細菌的實際量；(2)試紙型DNA生物傳感器僅能對有限物種進行分析，因為該方法依賴于物種特異性引物的PCR擴增，而目前與人類疾病相關的微生物序列信息沒有被完全破解或公布，其應用會受到一定的限制；(3)試紙型生物傳感器檢測到的細菌可能并不直接參與疾病的發?。?4)試紙型DNA生物傳感器多重檢測平臺的建立要克服多重PCR的難題，因此較難實現高通量檢測。隨著試紙型生物傳感器信號處理技術、探針技術以及多重PCR技術研究的不斷深入，試紙型生物傳感器在醫療設備不齊全的社區醫院、偏遠地區醫院，以及在基因分型、病原微生物檢測等方面將有著較好的應用前景。同時可以預見，試紙型生物傳感器在現場即時檢測方面也將有著廣泛的應用前景。

5 小 結

綜上所述，試紙型生物傳感器不需要復雜的設備、試劑或電源，具有良好的靈敏度和特異度，并且檢測快速、體積小巧、檢測成本低、易于使用和運輸，是適用于小型實驗室和現場即時檢測呼吸道病原體的理想平臺。