食源性原花青素對SH-SY5Y細胞生長的抑制作用及其機制

鐘 越，李海超，馮馨銳，崔雨舒，鄭中華，王瑋瑤，齊 玲,3

(1.吉林醫藥學院管理學院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院病理生理學教研室，吉林 吉林 132013；3. 廣州醫科大學附屬第六醫院 廣東省清遠市人民醫院，廣東 清遠 511518)

神經母細胞瘤的病變部位主要始于原始的神經峭[1]，是一種較為常見的兒童腫瘤，其具有發病率高、病變部位較多、易轉移和惡性度高等特點，其臨床治療非常困難[2-3]。雖然近年來的新型治療手段使神經母細胞瘤的治療有所改進，但由于患兒初診時多數即處于中晚期，再加上化療藥物耐藥，患兒的5年生存率僅為15%～25%[4]。原花青素主要來源于葡萄、山楂、銀杏和花生等品種[5]。在美國，食源性原花青素是民眾最信賴的十大植物藥之一，是公認的清除體內自由基的天然抗氧化劑。食源性原花青素水溶性好，對人體無明顯的毒副作用。本課題組前期研究[6]顯示：越桔原花青素具有良好的抗膠質瘤作用。但目前食源性原花青素對人神經母細胞瘤細胞生長的抑制作用尚未見相關報道。因此，本研究利用人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞作為研究對象，探討食源性原花青素對SH-SY5Y細胞生長的抑制作用，并闡明其抑制腫瘤細胞生長的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞系(吉林醫藥學院科研實驗中心提供)。食源性原花青素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，PBS緩沖液、高糖DMEM培養基、小牛血清和0.25%胰酶(美國Gibco公司)，噻唑藍(MTT)、二甲基亞楓(DMSO)、MuseTMAnnexin Ⅴ細胞凋亡試劑盒和細胞周期試劑盒(美國Millipore公司)。Muse智能觸控細胞狀態分析儀(德國Merck Millipore 公司)，CB150型CO2培養箱(德國Binder公司)，J-26XP 型超低溫高速離心機(美國貝克曼公司)，PLUS 384型全自動酶標儀(美國MDC公司)，Ⅸ-70型倒置式相差顯微鏡(日本Olympus 公司) 。

1.2 細胞培養 自液氮罐中取出凍存的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，置于37℃水浴箱中均勻振蕩1 min，再以800 r·min-1離心3 min，吸出上清后用含10%小牛血清的DMEM培養基重懸細胞，在37℃、5%CO2培養箱中孵育。每天倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，待細胞長至80%～90%融合進行傳代。

1.3 MTT法檢測SH-SY5Y細胞增殖率 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，以每孔6×103個細胞的密度將細胞接種于96孔培養板中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養過夜。將細胞分為對照組及10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組，次日開始分制加入含不同濃度(0、10、20和40 mg·L-1)食源性原花青素的培養基，基礎培養基為含5%小牛血清的DMEM，每個時間點(24、48和72 h)和每個濃度設5個復孔。待實驗終止每孔加入20 μL MTT孵育4 h，棄上清后每孔加入150 μL DMSO均勻振蕩10 min，在全自動酶標儀570 nm處測定各孔吸光度(A)值。根據A值計算細胞增殖率。細胞增殖率=(對照孔A值-用藥孔A值)/ 對照孔A值×100%。

1.4 流式細胞術檢測不同細胞周期SH-SY5Y細胞百分率 1×106個SH-SY5Y細胞接種于25 cm2培養瓶中培養，設對照組及10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組，待細胞生長至50%～60%，各組分別加入含0、10、20和40 mg·L-1食源性原花青素培養液(基礎培養基為含5%小牛血清的DMEM培養液)。置于37℃、5% CO2培養箱中培養72 h。待實驗結束，收集所有細胞，冷PBS洗滌離心，重懸細胞，70%乙醇固定。24 h后冷PBS再次洗滌細胞，200 μL細胞周期試劑重懸細胞，細胞密度為1×106mL-1，將試劑與細胞輕輕混勻，避光孵育30 min，200目濾網過濾，上機檢測各組不同細胞周期細胞百分率。

1.5 AnnexinⅤ凋亡試劑盒檢測SH-SY5Y細胞凋亡率 分組同1.4，待細胞生長至60%～70%融合，對照組加入含DMEM培養液，不同濃度食源性原花青素組加入含10、20和40 mg·L-1食源性原花青素的培養液(基礎培養基為含5%小牛血清的DMEM培養液)。置于37℃、5% CO2培養箱培養72 h。收集所有細胞，PBS洗滌并重懸細胞，細胞密度為1×106mL-1。加入Annexin Ⅴ溶液5 μL和PI 10 μL，冰浴10 min，上機檢測每組10 000個細胞中凋亡細胞數，計算各組細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 各組SH-SY5Y細胞增殖率 與對照組比較，各時間點10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組細胞增殖率均降低，作用48和72 h時

20 mg·L-1食源性原花青素組細胞增殖率差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，作用24、48和72 h時40 mg·L-1食源性原花青素組細胞增殖率差異有統計學意義(P<0.01)，且不同濃度食源性原花青素組細胞增殖率呈明顯的劑量依賴效應。由于72 h時作用效果最為明顯，選取72 h作為后續實驗的藥物作用時間。見表1。

2.2 各組不同細胞周期SH-SY5Y細胞百分率 流式細胞術檢測結果顯示：G0/G1期細胞百分率隨著藥物濃度的增加而升高，G2/M期細胞百分率隨藥物濃度增加而降低。與對照組比較，40 mg·L-1食源性原花青素組G0/G1期細胞百分率明顯升高(P<0.01)，G2/M期細胞百分率明顯降低(P<0.01)；而10和20 mg·L-1食源性原花青素組S期細胞百分率略有增加，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1和表2。

2.3 各組SH-SY5Y細胞凋亡率 與對照組(19.03%±3.05%)比較，10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組細胞凋亡率(66.81%±3.89%、72.81%±5.16%和78.92%±6.84%)均明顯升高(P<0.01)。見圖2。

表1 MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of SH-SY5Y cells in various groups detected by MTT assay

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

A: Control group; B-D:10，20, and 40 mg·L-1 foodborne procyanidins groups.圖1 流式細胞術檢測各組不同細胞周期SH-SY5Y細胞百分率Fig.1 Percentages of SH-SY5Y cells in different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

表2 各組不同細胞周期SH-SY5Y細胞百分率Tab.2 Percentages of SH-SY5Y cells in different cell cycles in various groups

*P<0.01vscontrol group.

A: Control group; B-D:10,20,and 40 mg·L-1 foodborne procyanidins group.圖2 Annexin Ⅴ法檢測各組SH-SY5Y細胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of SH-SY5Y cells in various groups detected by Annexin Ⅴ assay

3 討 論

原花青素廣泛存在于多種可食用植物如花生、蘋果和葡萄的核、皮等部位，日常生活中被人們所攝取和利用[6]。研究[7-8]表明：花生紅皮中的原花青素可以對抗前列腺癌細胞的增殖，蘋果提取出來的原花青素可以上調緊密連接蛋白的表達從而減少氧化應激反應和炎癥反應，而紅葡萄酒中的原花青素可以預防心血管疾病。吉林省食源性原花青素資源豐富，如越桔、葡萄和蘋果等[9-10]，因此對食源性原花青素進行深入研究與開發具有重要的意義。

在臨床上，人神經母細胞瘤的治療有多種方法，主要包括手術、化療、放療、干細胞移植、誘導分化治療、臍血移植和基因治療等[11]，但由于神經母細胞瘤生長迅速、易早期轉移、且惡性程度高，給治療帶來了諸多的困難。化療作為綜合治療的主要方法之一，一直被聯合應用于神經母細胞瘤的臨床治療中[12-13]。但化療藥物對患兒的不良反應較大，而食源性原花青素作為一種可食用的植物提取成分，具有不良反應輕和價格低廉等特點[14]。因此，本研究針對食源性原花青素，研究其對人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的抑制作用及機制。

本研究應用MTT法檢測食源性原花青素對SH-SY5Y細胞增殖率的影響，結果顯示：10、20和40 mg·L-1食源性原花青素作用于SH-SY5Y細胞時，細胞的增殖率均降低，且各濃度組的作用呈明顯的劑量依賴效應，說明食源性原花青素可以降低SH-SY5Y細胞增殖率。但是，腫瘤細胞之所以可以過度生長，主要是在細胞生長過程中激活了特殊的生長通路或抑制了其死亡通路，從而使細胞過度惡性增殖，在腫瘤細胞死亡的多種途徑中，誘導腫瘤凋亡始終是抗腫瘤藥物的最佳選擇途徑[15-16]。

細胞周期異常和細胞發生凋亡與腫瘤細胞化療敏感性有密切關聯，如果腫瘤細胞的細胞周期出現阻滯，則可加速細胞凋亡的發生[17]。因此，研究藥物治療引起的腫瘤細胞周期阻滯及細胞凋亡，對于臨床化療具有十分重要的意義。細胞周期是異常精密的過程，G0/G1期是化療藥物作用的主要位點，而G2/M期是細胞的高度增殖時相[18-19]。為明確食源性原花青素是否參與調控SH-SY5Y細胞的細胞周期，本研究采用流式細胞術檢測了SH-SY5Y細胞周期的變化，結果顯示：10、20和40 mg·L-1食源性原花青素作用于SH-SY5Y細胞后，G0/G1期細胞百分率隨著藥物濃度的增加而升高，G2/M期細胞的比例則呈現濃度遞減趨勢，表明食源性原花青素的確參與調控SH-SY5Y細胞的細胞周期，使細胞生長周期發生阻滯。

為了進一步明確食源性原花青素是否影響了SH-SY5Y細胞發生凋亡，本研究采用Annexin Ⅴ法檢測了SH-SY5Y細胞的凋亡率，結果顯示：各濃度食源性原花青素組SH-SY5Y細胞的凋亡率明顯升高，表明食源性原花青素可以誘導SH-SY5Y細胞發生凋亡，但凋亡的信號通路有很多，具體是激活哪條信號通路尚有待證實。總之，食源性原花青素可以明顯降低SH-SY5Y細胞的活性，抑制SH-SY5Y細胞的生長，其作用機制主要是使細胞周期發生阻滯和誘導腫瘤細胞凋亡。但食源性原花青素對SH-SY5Y細胞的具體作用機制還需要進一步研究。