3種體外培養方法誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化效果比較

周 巖， 金蓮花，盧 娜，韓立志

(吉林大學第一醫院小兒心血管科，吉林 長春 130021)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一種臨床常見的心肌病，該病預后差，5～10年生存率較低(30%～40%)[1-2]，目前尚無特效的治療藥物及治療方法[3]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)作為一類研究較早、較深入的成體干細胞，具有多種分化潛能，現已成為以干細胞為基礎的治療策略中不可或缺的重要種子細胞，對維持組織穩態和再生能力必不可少[4-5]。研究[6-8]表明：BMSCs可以分化為心肌細胞和血管內皮細胞，是目前心血管疾病細胞移植治療的理想種子細胞，已經成為國內外研究的熱點。但BMSCs向心肌細胞的分化率較低，其分化機制及誘導分化條件等問題均有待解決。本研究旨在探討在體外不同誘導條件下BMSCs分化為心肌細胞的作用，模擬DCM體內微環境誘導分化BMSCs，尋找BMSCs誘導分化為心肌細胞的最佳方法，為采用BMSCs移植治療DCM奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 Wistar大鼠乳鼠15只，出生5 d，購自吉林大學白求恩醫學院動物中心，動物許可證號：SCXK(吉)2013-0001。DCM大鼠為本課題組在前期工作中用阿霉素誘導制備。FITC 標記的CD44和CD105抗體、 PE標記的CD29和CD34抗體購自美國DAKO公司， 胎牛血清(FBS)和L-DMEM培養基購自美國Hyclone 公司，Trizol試劑盒購自美Invitrogen 公司，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和細胞漿蛋白抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術公司。VE-180型垂直電泳槽、VE-186轉移電泳儀和Tanon 1600型凝膠成像系統均購自上海天能科技有限公司， FACSCalibur 流式細胞儀購自美國BD 公司。

1.2 BMSCs的分離培養及鑒定 頸椎脫臼法處死出生5 d大鼠(體質量為8～10 g)，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下分離股骨脛骨，剪去骨兩端，收集細胞制成細胞懸液，置于37℃、5%CO2培養箱培養。選取生長狀態良好的第3代BMSCs，流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD34、CD44、CD29和CD105表達。同時采用成脂和成骨誘導劑誘導分化，觀察細胞形態表現，在成骨誘導培養后行堿性磷酸酶染色鑒定。成脂誘導培養后油紅O染色鑒定。

1.3 3種體外誘導方法培養大鼠BMSCs ①5-氮胞苷(5-aza)組： 3代BMSCs接種于6孔板內(孔內預置無菌蓋玻片)，24 h后換用含10 μmol·L-15-aza、10%FBS的L-DMEM培養基培養，培養24 h后棄去培養液更換為正常培養基繼續培養。②DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組：處死DCM模型大鼠，迅速取出心臟，預冷生理鹽水沖洗后，置于冰上，按150 mg組織加入1 mL L-DMEM培養基比例加入L-DMEM培養基，制備心肌細胞裂解液。采用DCM大鼠心肌細胞裂解液誘導培養大鼠BMSCs，誘導培養基為含10%心肌細胞裂解液和10%FBS的L-DMEM培養基。③DCM模型大鼠血清+5-aza組：腹主動脈采集DCM模型大鼠全血，分離血清，采用DCM大鼠血清+5-aza誘導培養BMSCs，誘導培養方法為5 μmol·L-15-aza干預培養24 h后去培養液，改用含20%DCM大鼠血清的L-DMEM培養基繼續培養。對照組BMSCs始終采用含10%FBS 的L-DMEM培養基在同等條件下培養，每3～4 d換液1次。

1.4 RT-PCR法檢測BMSCs中cTnT mRNA表達 采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA,檢測總RNA純度，A(260)/A(280)為1.9～2.1,說明RNA純度比較好，一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA, PCR擴增cDNA，取20 μL PCR產物于3%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。β-actin引物：147 bp，P1 5′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，P2 5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3′；cTnT引物： 202 bp，P1 5′-GCAGGCTCTTCATGCCCAACT-3′，P2 5′-CGC-

TCTGCCCGACGCTTTT-3′。

1.5 Western blotting法檢測BMSCs中 cTnT蛋白表達 冰浴下刮取細胞并裂解，4℃離心獲得的上清液即是總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制作蛋白電泳濃縮膠及分離膠，取30 μg蛋白上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h，半干式轉膜,5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗大鼠cTnT單抗，稀釋度為1∶100) 4℃過夜孵育,辣根過氧化物酶標記二抗溶液室溫孵育1 h，DAB顯色，凝膠成像系統攝片，觀察cTnT蛋白表達情況。

1.6 免疫組織化學法檢測BMSCs中cTnT陽性表達率 取出細胞爬片 PBS沖洗2 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，3%過氧化氫甲醇液浸泡30 min，封閉內源性過氧化物酶，1%Triton X-100破膜，PBS沖洗后，按照免疫組織化學試劑盒說明書操作。結果判定：細胞胞漿內出現棕褐色顆粒為陽性,每組觀察計數5個低倍視野，計算cTnT陽性表達率。

2 結 果

2.1 大鼠BMSCs的分離培養及鑒定 分離獲得的細胞培養48 h后換液，鏡下可見部分呈梭形生長的貼壁細胞，少數細胞為多角形；培養7～10 d單層生長細胞達80%～90%融合，呈旋渦狀排列(圖 1)。第3代BMSCs高表達MSCs的特征性表面標記CD44、CD29和CD105，不表達造血干細胞的特征性表面標志CD34(圖 2)。BMSCs成骨誘導培養基培養下分化為成骨細胞，堿性磷酸酶染色陽性，胞漿內有灰黑色沉淀；在成脂肪誘導培養基培養下分化為脂肪細胞，油紅O染色陽性，胞漿內有橘紅色脂肪滴(圖3，見插頁五)。

A：BMSCs (4 d); B：BMSCs (10 d);C: Subculture for 24 h(passage 3); D: Subculture for 7 d (passage 3).圖1 BMSCs的形態表現 (×40)Fig.1 Morphology of BMSCs(×40)

A:FITC-control;B:CD44;C:CD105;D:PE-control;E:CD29;F:CD34.圖2 流式細胞術檢測BMSCs表面抗原的表達Fig.2 Expressions of surface antigens of BMSCs detected by flow cytometry

A:Oil red O staining; B: Alkaline phosphates staining.
圖3 BMSCs的脂肪和成骨分化 (×100)
Fig.3 Adipogenic and osteogenic differentiation of BMSCs(×100)

2.2 3種體外培養方法誘導培養的大鼠BMSCs形態表現 對照組BMSCs呈成纖維細胞樣整齊排列，未發生形態改變(圖4)。5-aza組BMSCs誘導培養7 d，細胞增大明顯，逐漸變為短柱狀，排列方向一致，細胞增殖減慢，部分細胞脫壁死亡；隨著培養時間的延長，貼壁細胞數量較同期對照組明顯減少，形態多樣，胞漿粗糙，2周后出現肌絲樣結構(圖5)；DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組BMSCs生長狀態較5-aza組好，誘導培養7 d，細胞變寬，呈柱狀，排列具有方向性，2周后出現肌絲樣結構(圖 6)。DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs生長狀態明顯優于前2組，7 d后細胞形態發生明顯變化，多緊密平行排列生長，體積變大；隨著培養時間的延長梭形細胞的比例下降，多呈桿狀，少數細胞呈不規則外形，相鄰細胞間的胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀(圖7)。

A: Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖4 對照組大鼠BMSCs形態表現 (×100)Fig.4 Morphology of rat BMSCs in control group(×100)

A: Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖5 5-aza組大鼠BMSCs形態表現 (×100)Fig.5 Morphology of rat BMSCs in 5-aza group(×100)

A:Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖6 DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組BMSCs形態表現 (×100)Fig.6 Morphology of rat BMSCs in DCM model rat myocardial cell cleavage group(×100)

A: Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖7 DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs形態表現(×100)Fig.7 Morphology of rat BMSCs in DCM model rat serum +5-aza group(×100)

2.3 各組大鼠BMSCs 中cTnT mRNA和蛋白表達 5-aza組、DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組和DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs誘導培養28 d后，均可見cTnT mRNA和蛋白表達，對照組BMSCs中未見cTnT mRNA和蛋白表達(圖 8)。免疫組織化學染色結果顯示：5-aza組、DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組和DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs體外誘導培養7、14、21和28 d時cTnT均呈陽性表達，隨時間延長，cTnT陽性表達率明顯增高，DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs中cTnT陽性表達率最高； 21和28 d時,與5-aza組和DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組比較，DCM模型大鼠血清+5-aza組 BMSCs中cTnT陽性表達率明顯升高(P=0.048，P=0.036；P=0.026，P=0.020)。對照組BMSCs中未見cTnT表達。見圖9(插頁五)和表1。

Lane 1: Control group; Lane 2: 5-aza group; Lane 3: DCM model rat myocardial cell cleavage group;Lane 4: DCM model rat serum +5-aza group.
圖8 各組BMSCs中cTnT mRNA(A)和蛋白表達(B)電泳圖
Fig.8 Expressions of cTnT mRNA(A) and protein (B) in BMSCs in various groups

表1 各組大鼠BMSCs中cTnT陽性表達率Tab.1 Positive expression rates of cTnT in BMSCs in various groups

*P<0.05 compared with 5-aza group;△P<0.05 compared with DCM model rat myocardial cell cleavage group.

3 討 論

BMSCs來源廣泛，具有低免疫原性、可以分化為多種組織細胞且分離培養較為容易，在組織器官損傷性疾病、組織器官退行性疾病和遺傳缺陷疾病等領域具有廣泛的應用前景。研究[9]表明：BMSCs可以分化為心肌細胞和血管內皮細胞,已經成為心血管疾病細胞移植治療的理想種子細胞，是近年來心血管疾病領域的研究熱點。

5-aza是胞嘧啶核苷的一個類似物，是一種去甲基化藥物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化，從而使控制向心肌分化的特定調控基因阻遏蛋白去甲基化而發生構型改變，促進BMSCs向心肌細胞分化。1995年WAKITANI等[10]首先證實間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)在體外經5-aza誘導后分化成心肌樣細胞，分化率約為30%。有文獻[11-14]報道：5-aza能誘導BMSCs分化為心肌表型，10 μmol·L-1為5-aza誘導BMSCs的最佳劑量，但是隨著誘導時間的延長，其對細胞的毒性也會越來越大，可以引起干細胞的凋亡。干細胞進入體內不同器官能在不同的環境及生長因子作用下發生定向分化，其中微環境是誘導干細胞分化的關鍵因素。在體外模擬心肌微環境，可高效誘導BMSCs分化為心肌細胞。如通過體外心肌細胞與MSCs共同培養、添加心肌細胞裂解液和添加心肌細胞條件培養液等體外模擬心肌微環境的方法均可誘導BMSCs分化為心肌細胞[15-16]。本研究中，大鼠BMSCs分為3組，5-aza組采用10 μmol· L-15-aza進行誘導，DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組采用DCM大鼠心肌細胞裂解液進行誘導，DCM模型大鼠血清+5-aza組采取減少5-aza用量(5 μmol·L-1)并結合DCM大鼠血清進行誘導，觀察采用不同誘導方法培養后BMSCs向心肌細胞分化的效果。本研究結果顯示：DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs生長狀態明顯優于5-aza組和DCM模型大鼠心肌細胞裂解液組，7 d后細胞形態出現變化，多緊密平行排列生長,體積變大，隨著培養時間的延長梭形細胞的比例下降，多呈桿狀，少數細胞呈不規則外形,相鄰細胞間的胞膜有接觸，排列具有方向性，逐漸相連呈肌管狀。cTnT是心肌肌鈣蛋白中具有較高特異性的亞型，是鑒定心肌源性細胞的特異性標志物[17-20]。本研究中RT-PCR法和Western blotting法檢測結果顯示：3組BMSCs體外誘導培養后均可見cTnT mRNA和蛋白表達；免疫組織化學染色結果顯示：隨時間延長，cTnT陽性表達率逐漸升高，DCM模型大鼠血清+5-aza組cTnT表達陽性率最高。研究[21-23]表明：心肌微環境中的各種因素為MSCs向心肌細胞定向分化提供了關鍵的信號，即“環境誘導分化”，包括化學性因素和物理性因素。化學因素包括細胞因子、激素、離子梯度和其他可溶性因子；物理性因素可能包括細胞間的直接/間接接觸，剛性細胞外基質，流體剪切應力和機械張力等[24]。本研究在體外采用DCM模型大鼠心肌細胞裂解液和DCM模型大鼠血清+5-aza培養BMSCs均顯示出較好的向心肌細胞分化的結果，均比單純應用5-aza誘導效果好，其機制考慮與心肌損傷后產生的細胞因子、激素和可溶性因子等有關。本研究采用10 μmol·L-15-aza 對BMSCs進行誘導，可以使其向心肌細胞分化，但在培養過程中呈現細胞生長狀態差，出現較多的細胞脫壁死亡,考慮與5-aza的細胞毒性有關；但DCM模型大鼠心肌細胞裂解液和DCM模型大鼠血清+5-aza(5 μmol·L-1)誘導組細胞生長狀態良好，出現細胞脫壁死亡的數量較少,考慮DCM模型大鼠心肌細胞裂解液及血清均可誘導BMSCs向心肌細胞分化。本研究中DCM模型大鼠血清+5-aza(5 μmol·L-1)組細胞生長狀態及向心肌細胞分化的結果最佳。推測其原因可能為：一方面DCM大鼠模型血清可能含有相關細胞因子等誘導BMSCs向心肌細胞分化；另一方面與減少5-aza的劑量，降低了5-aza的細胞毒性有關。

A: Control group;B: 5-aza group;C: DCM rat model myocardial cell cleavage group;D: DCM rat serum +5-aza group.
圖9 各組大鼠BMSCs中cTnT的表達情況(免疫組織化學,×100)
Fig.9 Expressions of cTnT in BMSCs of rats in various groups (Immunohistochemistry,×100)

綜上所述，本研究采用5-aza、DCM模型大鼠的心肌細胞裂解液、DCM模型大鼠血清+5-aza 3種方法體外誘導大鼠BMSCs向心肌細胞分化，DCM模型大鼠血清+5-aza組細胞生長狀態最佳，心肌源性細胞的特異性標志物cTnT表達最高，向心肌細胞分化的結果最佳。本研究結果為BMSCs移植治療DCM奠定了基礎。