miR-125b對大鼠心肌梗死后心室重構的調控作用

萬 琦，余寶剛

(河北醫科大學附屬唐山工人醫院急診內科，河北 唐山 063000)

心室重構的病理基礎為：在心肌梗死區，壞死心肌細胞由瘢痕組織取代[1]；在非心肌梗死區，心肌細胞發生凋亡，細胞外基質網絡結構重建，導致心臟功能和結構異常，進一步發展為心力衰竭，嚴重影響患者的生命健康。因此探討心肌梗死后心室重構的機制對其診治具有重要意義[2]。研究[3-4]顯示：微小RNA-125b(micro RNA-125b，miR-125b)在心肌纖維化中發揮重要作用，抑制miR-125b可抑制心肌梗死后心室重構，但其具體機制尚不十分清楚。研究[5-6]表明：miR-125b可通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylionsitol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases，Akt)等多種信號通路參與疾病的發生發展過程，PI3K/Akt信號通路的激活對心肌組織有保護作用。本研究擬探討miR-125b通過PI3K/Akt信號通路對大鼠心肌梗死后心室重構的影響,闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康、清潔級SD大鼠75只，12周齡，雌雄各半，體質量200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-0008。miR-125b 抑制物(中國廣州銳博生物科技有限公司)，蘇木素、Masson試劑盒和免疫熒光試劑盒(美國Sigma公司)，兔抗鼠心鈉肽(ANP)單克隆抗體、兔抗鼠腦鈉肽(BNP)單克隆抗體、兔抗鼠PI3K單克隆抗體、兔抗鼠Akt單克隆抗體和兔抗鼠磷酸化Akt (p-Akt)單克隆抗體(美國Abcam公司)。凝膠成像儀和電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物分組、建模及處理 75只大鼠隨機分為假手術組、心肌梗死組和miR-125b抑制物組，每組25只。心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠建立急性心肌梗死模型：將大鼠禁食12 h后水合氯醛腹腔注射麻醉，氣管插管、連接動物呼吸機，監測心電圖；將大鼠備皮消毒后從左外側經第3肋間隙切口進入胸腔，暴露大鼠心臟，結扎左冠狀動脈前降支，心電圖ST-T弓背向上抬、左室前壁顏色變白表示心肌梗死動物模型建立成功。假手術組大鼠前降支只穿線，不結扎。術后24 h，miR-125b抑制物組大鼠經尾靜脈注射miR-125b抑制物(80 mg·kg-1)，假手術組和心肌梗死組大鼠經尾靜脈注射等量生理鹽水，每周1次，共4周。4周后假手術組大鼠死亡3只，模型組大鼠死亡5只，miR-125b抑制物組大鼠死亡4只。最終每組取20只大鼠進行各指標測量：每組取10只大鼠的心臟組織進行HE染色、Masson染色和免疫熒光染色；每組取剩余10只大鼠心臟組織用于左心室肥厚指數測定和Western blotting法測定。

1.3 左心室肥厚指數測定 4周后電子天平稱大鼠體質量，處死大鼠取心臟，剪去大血管和左右心耳，沖洗干凈，電子天平秤稱質量。剪去右心室和左右心房，將左心室及室間隔稱質量，計算左心室肥厚指數，包括心臟質量/體質量(HW/BW)、(左心室+室間隔)質量/體質量[(LV+S)/BW]和(左心室+室間隔)質量/心臟質量[(LV+S)/HW]。

1.4 HE染色觀察大鼠心肌組織形態表現 處死大鼠，取心臟組織置于甲醛中固定，經脫水、石蠟包埋，切成厚度為4 μm切片，常規進行HE染色，觀察各組大鼠心肌組織形態表現。

1.5 Masson染色觀察心肌組織纖維化情況 將各組大鼠心肌組織烤片60 min，經脫蠟至水，蘇木素染色10 min，鹽酸酒精分化10 s，麗春紅酸性品紅染色5 min，苯胺藍復染15 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍片觀察染色情況。藍色為膠原纖維，紅色為心肌細胞。采用Image Pro Plus 6.0軟件計算大鼠心肌膠原容積積分，膠原容積積分=膠原面積/總面積×100%。

1.6 免疫熒光染色法觀察大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平 將各組大鼠心肌組織切片加入丙酮固定，PBS液沖洗，山羊血清封閉，加入一抗(兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白單克隆抗體和兔抗鼠Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體)(1∶1 000)過夜孵育，PBS沖洗，加入異硫氰酸熒光素標記的二抗(1∶200)孵育1 h，PBS沖洗，甘油封片，200倍光鏡下觀察免疫熒光染色情況。采用Image Pro Plus 6.0分析軟件測定目標蛋白熒光強度即積分光密度(IOD)值，代表目的蛋白表達水平。

1.7 Western blotting法測定大鼠心肌梗死周邊區組織中ANP、BNP、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平 取3組大鼠左心室梗死和非梗死交界處心肌組織，采用全蛋白提取法提取心肌梗死周邊區總蛋白，BCA法測定3組蛋白濃度，每組取50 μg上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質，經轉膜后加入一抗：兔抗鼠ANP單克隆抗體(1∶600)、兔抗鼠BNP單克隆抗體(1∶600)、兔抗鼠PI3K單克隆抗體(1∶800)、兔抗鼠Akt單克隆抗體(1∶700)和兔抗鼠p-Akt單克隆抗體(1∶600)過夜孵育，加入熒光二抗(1∶4 000)孵育1 h，以β-actin為內參照，采用Fusion生物凝膠圖像分析系統掃描各條帶吸光度(A)值。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶A值/β-actin條帶A值。

2 結 果

2.1 各組大鼠左心室肥厚指數 與假手術組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠HW/BW、(LV+S)/BW和(LV+S)/HW均明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠HW/BW、(LV+S)/BW和(LV+S)/HW明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠左心室肥厚指數Tab.1 Left ventricular hypertrophy indexes of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

2.2 各組大鼠心肌組織形態表現 假手術組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞核明顯；心肌梗死組大鼠心肌細胞排列紊亂，形態不規則，腫脹、增粗明顯，細胞間隙可見大量網狀分布膠原纖維增生，并有明顯炎性細胞浸潤；miR-125b抑制物組大鼠心肌細胞排列較為整齊。見圖1(插頁六)。

A:Sham operation group;B:Myocardial infarction group;C:MiR-125b inhibitor group.
圖1 各組大鼠心肌組織形態表現(HE，×200)
Fig.1 Morphology of myocardium tissue of rats in various groups (HE，×200)

2.3 各組大鼠心肌組織纖維化情況 假手術組大鼠心肌組織呈均勻紅色，無融合及條索狀膠原纖維；心肌梗死組大鼠梗死區心肌組織可見大量膠原纖維，呈條索狀分割心肌束；miR-125b抑制物組大鼠心肌組織膠原纖維明顯減少。與假手術組(5.31%±1.24%)比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌組織膠原容積積分(47.63%±1.18%和13.51%±0.98%)明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌組織膠原容積積分明顯降低(P<0.05)。見圖2(插頁六)。

A:Sham operation group;B:Myocardial infarction group;C:MiR-125b inhibitor group.
圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色結果(×200)
Fig.2 Masson staining results of myocardium tissue of rats in various groups (×200)

2.4 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平 與假手術組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2和圖3(插頁六)。

A-C: Type Ⅰ collagen;D-F: Type Ⅲ collagen;A,D:Sham operation group;B,E:Myocardial infarction group;C,F:MiR-125b inhibitor group.
圖3 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原免疫熒光染色結果(×200)
Fig.3 Immunofluorescence staining results of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in myocardium tissue of rats in various groups (×200)

表2 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen proteins in myocardium tissue of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

2.5 各組大鼠心肌梗死周邊區組織中ANP和BNP蛋白表達水平 與假手術組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區組織中ANP和BNP蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區組織中ANP和BNP蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表3和圖4。

2.6 各組大鼠心肌梗死周邊區組織中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平 各組大鼠心肌梗死周邊區組織中Akt蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，PI3K和p-Akt蛋白表達水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。與假手術組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區組織中PI3K和p-Akt蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區組織中PI3K和p-Akt蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見表4和圖5。

表3 各組大鼠心肌梗死周邊區組織中ANP和BNP蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of ANP and BNP proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

Lane 1:Sham operation group; Lane 2:Myocardial infarction group; Lane 3:MiR-125b inhibitor group.
圖4 各組大鼠心肌梗死周邊區組織中ANP和BNP蛋白表達電泳圖
Fig.4 Electrophoregram of expressions of ANP and BNP proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

3 討 論

心肌梗死可引起心肌成纖維細胞、心肌細胞和細胞外基質代償性活化，分泌大量膠原蛋白，損傷心肌組織功能，造成心肌纖維化和心室重構等病理過程，最終導致心力衰竭的發生[7-8]。心臟非梗死區心肌纖維化是心室重構進展的關鍵環節[9]，因此研究心肌細胞纖維化的調控機制對于防治心力衰竭具有重要作用。

miRNA為內源性RNA，相對分子質量小，可結合靶mRNA的編碼區、3′端非編碼區和5′端非編碼區，在轉錄后對相關基因的表達進行調控，降解或抑制靶mRNA翻譯，參與細胞增殖、分化和凋亡等多種病理生理進程[10]。近年來研究[11-12]顯示：miRNA在心血管疾病及心臟病理生理過程中發揮重要作用，在心力衰竭和心肌肥厚等心血管疾病中均存在miRNA表達異常，在心室重構中也存在miRNA異常表達。miR-125b 在心肌纖維化中具有重要作用，miR-125b模擬物轉染可上調成人心臟成纖維細胞中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和α-平滑肌肌動蛋白水平，促進成人心臟成纖維細胞增殖、遷移和凋亡，通過轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smad通路參與心肌纖維化進程[13]。miR-125b可介導預防心肌梗塞中的細胞死亡促進心臟修復[14]。本研究結果顯示：心肌梗死大鼠左心室肥厚指數和膠原容積積分升高，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、ANP和BNP蛋白水平表達水平明顯升高。ANP和BNP為重要的心臟內分泌激素，梗死交界區ANP和BNP水平可反映心肌梗死局部張力，是心肌細胞病理性肥大的比較可靠的指標，在判定心室重構中具有重要價值[15-16]。本研究結果表明：心肌梗死模型大鼠心肌肥厚，存在心肌纖維化和心室重構，給予miR-125b抑制物處理后，心肌梗死模型大鼠左心室肥厚指數和膠原容積積分降低，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、ANP和BNP蛋白水平降低，表明抑制miR-125b可抑制心肌梗死模型大鼠心肌肥厚，改善心肌纖維化和心室重構。

表4 各組大鼠心肌梗死周邊區組織中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平Tab.4 Expession levels of PI3K, Akt and p-Akt proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

Lane 1:Sham operation group; Lane 2:Myocardial infarction group; Lane 3:MiR-125b inhibitor group.
圖5 各組大鼠心肌梗死周邊區組織中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達電泳圖
Fig.5 Electrophoregram of expessions of PI3K,Akt and p-Akt proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

miR-125b參與心肌纖維化和心室重構過程，但其作用機制尚不清楚。miR-125b可通過多種信號通路參與疾病的發生發展過程，過表達miR-125b可通過PI3K/Akt信號通路抑制子宮內膜癌HEC-1B細胞周期和細胞增殖，抑制細胞凋亡[17]。PI3K/Akt信號通路參與心肌纖維化進程，如調節第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源性基因(PTEN)-PI3K / AKT信號通路可調節心肌梗死后的心肌纖維化[18]；PI3K/Akt通路介導TRPV1抑制離體大鼠心臟缺血再灌注后的細胞凋亡[19]；PI3K/AKT信號通路在甲狀腺素誘導的大鼠心肌細胞凋亡中具有重要作用[20]。本研究結果顯示：心肌梗死后心室重構大鼠心肌梗死周邊區組織中PI3K和p-Akt蛋白表達水平明顯降低，給予miR-125b抑制物處理后心肌梗死大鼠心肌梗死周邊區組織中PI3K和p-Akt蛋白表達水平升高，表明心肌梗死后心室重構大鼠心肌梗死周邊存在PI3K/Akt信號通路抑制，抑制miR-125b可通過激活PI3K/Akt信號通路發揮抑制心肌纖維化和心室重構的作用。

綜上所述，抑制miR-125b的表達可抑制心肌梗死后心室重構進程，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關。