潰瘍性結腸炎的動物模型研究進展

石 磊，李軍祥，史 瑞，王志斌，余軼群，毛堂友，路瓊瓊，孫中美，韓 嘯，郝 鈺

潰瘍性結腸炎(ulecerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's disease, CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)中最常見的疾病。UC是發(fā)生在結直腸、原因尚不明確的慢性非特異性炎癥性疾病，本病好發(fā)于中青年，腹瀉、黏液膿血便、腹痛等癥狀嚴重影響患者生活質量。其發(fā)病復雜，涉及遺傳、免疫、菌群等多個方面，因本病難治愈、易復發(fā)、癌變風險高、往往需要終生服藥，世界衛(wèi)生組織將其列為現(xiàn)代難治病之一。因此，開展UC的發(fā)病和藥效學研究就顯得非常有意義。為更好地開展針對UC的臨床前研究、藥效觀察或發(fā)病學研究，動物模型成為研究過程中不可或缺的手段。雖然UC與CD涉及的發(fā)病機制不同，但二者在臨床表現(xiàn)中有很大的相似之處。因此，很大一部分實驗仍然直接以傳統(tǒng)的方法建立IBD模型，并沒有科學區(qū)分UC與CD模型，這也就直接影響了研究結論的可靠性。

根據UC動物模型建立的方法不同，可以歸納為化學性、免疫和基因修飾性兩大類，通過不同方法建立的UC動物模型，也有其更加適合的研究意義和歸屬。因此，本文主要對近年來不同的UC動物模型及其側重點進行綜述，以期對UC的動物實驗提供思路。

1 化學性模型

1.1葡聚糖硫酸鈉模型 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)模型最初由Okayasu等[1]科學家所報道，由于DSS化學誘導結腸炎癥導致的腸上皮形態(tài)損傷和癥狀類似于UC在人體中的表現(xiàn)，因此，這種簡單而可重復性的動物模型被廣泛應用于UC的基礎研究，也是使用最多的方法[2]。DSS是一種水溶性、帶有負電荷的硫酸化多糖，分子量從5～1400 kDa不等，向飲用水中添加40～50 kDa的DSS就能導致小鼠結腸炎癥的發(fā)生。在DSS模型中，硫酸化多糖不會直接誘導腸道炎癥，而是作為結腸上皮的直接化學毒素，引起腸上皮細胞損傷和黏膜層的破壞，導致腸腔內細菌、其他抗原和促炎物質進入黏膜或黏膜下層，從而引發(fā)炎癥反應[3]。

文獻證實，包括UC在內的IBD，其腸屏障的功能障礙主要體現(xiàn)在緊密連接的表達變化，以及在炎癥狀態(tài)下，黏膜的黏附性下降[4]。DSS主要通過破壞IEC之間的緊密連接結構、減少黏蛋白數量，并影響?zhàn)ひ簩印⒋蚱乒逃芯旱姆植加绊懳⒕簲盗縖5-6]，從多方面破壞腸屏障并提高腸屏障的通透性，使有害的大分子物質等可以順利通過腸屏障或發(fā)生菌群易位，這種病理性的定植、侵入會刺激先天和適應性免疫應答，以及促炎細胞因子和趨化因子的分泌，還能導致具有細胞毒性潛力的細胞的侵入，如中性粒細胞和炎性巨噬細胞。

DSS誘導的結腸炎癥是否有效依賴于以下因素，包括DSS濃度(通常為1%～5%)、給藥的持續(xù)時間和頻率(建立急性或慢性)、DSS的分子量、動物的適應性(C3H/HeJ、C57BL/6和BALB/c小鼠品系更易感)和動物本身或飼養(yǎng)條件的微生物環(huán)境[7]，根據上述因素的不同，可以建立包括不同時期、不同活動度的動物模型。

DSS模型可主要用于研究腸炎誘導過程中的先天免疫機制，包括Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)、C型凝集素受體或炎性小體等刺激[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR2-/-、TLR4-/-和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)-/-等基因缺失鼠，在DSS模型中，通過影響TLR信號通路，表現(xiàn)出UC病程的惡化，原因可能是依賴于這些先天免疫信號的腸上皮細胞和巨噬細胞中的信號通路，能夠促進腸上皮增殖、腸屏障重建、限制細菌移位及局限炎癥，而腸上皮的破壞會使先天免疫功能遭到一定程度的損傷[9]。該模型另一種重要用途就是在上皮重建過程中，涉及多種信號通路的相互作用和長期結腸炎癥導致結腸癌的相關機制研究[10-11]。有研究證實，缺乏由腸上皮特異性產生NLRP6的小鼠，在DSS模型中會表現(xiàn)出更嚴重的病情，可能由于NLRP6可通過調控隱窩中Prevotellaceae菌的生長從而影響白介素-18(interleukin-18, IL-18)的分泌[12]。因此，DSS模型還可用于腸道菌群在結腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用研究。

DSS模型由于多采用自由飲用的方式，每只動物的飲用量無法精確操控，可能出現(xiàn)研究偏倚，可能對結果造成一定的影響。有條件的實驗室團隊，可以采用單籠飼養(yǎng)以盡量保證每只動物的飲用量。如果采用群養(yǎng)的方法，預先準備的DSS溶液一定要保證每日都能有剩余，減少因競爭飲水引起的給藥量不足。

1.22,4,6-三硝基苯磺酸模型 該模型的建立多采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)聯(lián)合不同濃度乙醇的方法，使結腸黏膜遭到不同濃度乙醇刺激灼傷后，黏液層被溶解、破壞，損傷了腸上皮細胞和腸屏障功能，繼而使TNBS進入黏膜內與構成組織蛋白的賴氨酸ε-氨基團結合，作為完全抗原引起黏膜的免疫反應，進而引起級聯(lián)式的免疫應答[13]。在大鼠體內，有文獻采用10 mg TNBS溶于0.25 ml的50%乙醇，在距離肛門約8 cm處滴注灌腸[14]；也有采用0.6 ml終濃度為33.3%的TNBS/無水乙醇混合溶液進行灌腸的方法[15]。小鼠則采用200 mg/kg TNBS溶于30%乙醇，在距肛門3～4 cm處灌腸的方法建立模型[16]。

TNBS模型主要引起以Th1介導的免疫反應，表現(xiàn)為黏膜固有層CD4+ T細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤增多，可出現(xiàn)嚴重的腹瀉甚至直腸脫垂。另有研究發(fā)現(xiàn)，TNBS應用于SJL/J或C57BL/10小鼠，可引起透壁性結腸炎，表現(xiàn)更接近于CD[17]。也有研究指出，TNBS模型以Th1/Th17占主導的免疫失衡為主[18]。因此該模型更適用于研究依賴于CD4+ T細胞免疫功能的腸道炎癥反應。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在BALB/c小鼠中，慢性TNBS腸炎模型特征是黏膜固有層的持續(xù)性纖維化，因此認為這種TNBS慢性模型是一種針對人類IBD出現(xiàn)腸道纖維化潛在病理機制研究的適合工具[19]。

1.3惡唑酮模型 惡唑酮(oxazolone, OXZ)是染料、農藥等化學物質的重要中間體，同時也是一種經典的半抗原。將其作用于動物身體的各個部位，均可誘發(fā)接觸性過敏反應[20]。研究表明，OXZ模型是由IL-4過量引發(fā)的Th2型炎癥，其組織學變化特征符合人類的UC表現(xiàn)[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，OXZ在小鼠直腸內給藥后，能造成嚴重的結腸炎模型，表現(xiàn)出遠端結腸黏膜和黏膜下層的急性炎癥，并伴有潰瘍和固有層隱窩內中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤[22]。SJL/J和C57BL/10小鼠對OXZ高度敏感，但C57BL/10小鼠對其又有較強的抵抗力，在該品種小鼠身上建立OXZ模型前，往往需要進行皮膚OXZ的預致敏操作[23]。

OXZ模型與其他IBD模型相比，更加接近UC表現(xiàn)，其病理特征除上述組織學改變外，還體現(xiàn)在遠端結腸的炎癥反應、2型和9型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)的分泌增加，固有層內T細胞表現(xiàn)也與人類UC中觀察到的特征相類似[24]。有研究指出，在CD1d抗原遞呈激活了自然殺傷T細胞(natural killer T cells，NKT)后[25]，NKT分泌的IL-13為疾病的重要觸發(fā)因素，在向T細胞、B細胞和T細胞產生IL-9信號轉導過程中，IL-4R起了關鍵性的作用[26]。因此，OXZ模型更適合用于研究腸道炎癥過程中2型、9型細胞因子相關的免疫反應。此外，小劑量的OXZ可以引起混合型的Th1/Th2免疫反應，這也提示研究者，OXZ在不同品系動物身上建立模型，需要根據研究目的的不同，自行摸索最佳合適的劑量。反復接受OXZ刺激，BALB/c小鼠可發(fā)展為慢性結腸炎，這種慢性腸炎模型與人類慢性UC比較接近，可用于慢性UC中的相關機制研究[23]。

模型建立的推薦方法包括：①大鼠：用300 μl含5% OXZ的無水乙醇對腹部皮膚進行預致敏，在致敏后的第5天和第7天，行直腸內灌腸給藥，藥量為450 μl含5% OXZ的50%乙醇溶液。②小鼠：用50～150 μl含3% OXZ的無水乙醇對腹部皮膚進行預致敏，在致敏后的5～8 d，行直腸內灌腸給藥，藥量為70～150 μl含0.75%～1% OXZ的45%～50%乙醇溶液[2]。

1.4乙酸模型 乙酸是另一種較常使用、容易誘導結腸炎的化學物質。該模型通過乙酸的直接刺激作用使結腸IEC凋亡增加，黏膜屏障遭到破壞，從而使炎癥介質大量釋放，誘導炎癥發(fā)生[27]。有研究認為，乙酸模型與人類的IBD在病理學表現(xiàn)、發(fā)病機制和炎癥介質的表達分泌均較為相似，可以較好地模擬IBD發(fā)病[28]。研究發(fā)現(xiàn)，直腸內給予稀釋后的乙酸溶液可以引起黏膜的非透壁炎癥，其特征是腸黏膜內中性粒細胞浸潤增加，黏膜和黏膜下層的大范圍壞死，血管擴張，水腫和黏膜下的淺潰瘍，而這些表現(xiàn)與人類UC有非常相似的特征[29]。有學者認為，乙酸模型是利用乙酸對IEC的直接刺激作用，引起結腸部位出現(xiàn)急性化學損傷，不能確切地反映人類UC發(fā)病過程的免疫學變化，故而不適合免疫發(fā)病機制的相關研究[30]。但另有學者認為，乙酸模型在最初24 h內上皮損傷性質上不是免疫學導致的，因此如果設計針對免疫反應的藥物，應當在成功誘導模型24 h后進行[31]。

在乙酸模型中，乙酸以質子化形式進入細胞內，可能導致細胞內酸化，導致更進一步的上皮細胞損傷。氧化應激很可能在IBD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[32]。由于在IBD患者中發(fā)現(xiàn)高水平的超氧離子、過氧化氫、次氯酸、羥自由基以及含氮的活性氧，提示氧化應激是IBD中的關鍵致病因素[33]。同樣，在使用乙酸誘導結腸炎的動物模型中，也有氧化和抗氧化物質之間的不平衡特征出現(xiàn)[34]。有文獻證明，中性粒細胞的浸潤導致超氧離子的產生并引發(fā)級聯(lián)反應產生氧活性物質，這些氧活性物質對于組織壞死和黏膜功能障礙的進展具有促進作用[35]。值得注意的是，乙酸模型存在一定的自愈性，不適合進行慢性模型的建立。

1.5角叉菜膠模型 角叉菜膠是從紅藻中分離獲得的高分子硫酸化多糖。基于硫酸化程度和溶解度的不同，可以被分為κ、ι和λ三種不同的亞型。角叉菜膠本身對IEC沒有直接損傷作用，但水解后的產物會引起包括豚鼠在內的多種動物(兔、大鼠、小鼠)發(fā)生結腸潰瘍[2]。很早就有研究指出，當在豚鼠飲用水中添加降解的角叉菜膠時，30 d后豚鼠大腸中100%會出現(xiàn)潰瘍[36]。λ-角叉菜膠誘導的IBD大鼠模型，隨著時間的推移，其腸道的組織病理學和大體病變都逐漸與人類UC的表現(xiàn)相吻合[37]。

角叉菜膠在動物模型中誘導炎癥的具體機制尚不清楚，但已證明角叉菜膠可減少結腸中上皮糖蛋白的數量，并能抑制巨噬細胞和淋巴細胞之間的相互作用[38]。使用TLR4-和MyD88-缺陷小鼠證實了TLR4和IL-6參與了對角叉菜膠的先天免疫反應[39]。有研究在TNBS的BALB/c小鼠結腸炎模型中發(fā)現(xiàn)，用角叉菜膠預處理加重了TNBS結腸炎的嚴重程度(包括癥狀和組織學)，同時伴隨著IL-6和腫瘤壞死因子-α的表達增加和IL-10的減少[40]。通過這些動物研究已經得出這樣的假設，角叉菜膠可以作為條件性炎癥劑，放大由病原體引起的任何現(xiàn)有的腸道慢性炎癥[41]。

此外，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，角叉菜膠模型可更好的用于腸道微生物的相關機制研究。用角叉菜膠和甲硝唑同時干預常規(guī)豚鼠，已被證明可以預防潰瘍的發(fā)展[42]。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用角叉菜膠之前用B.vulgatus菌免疫的動物比單獨使用角叉菜膠的動物，將會更快發(fā)展為實驗性結腸炎，且病情更為嚴重[43]。目前，角叉菜膠的動物模型以豚鼠居多，飼養(yǎng)成本較高。

2 免疫與基因修飾模型

2.1CD4+ CD45RBHighT細胞移植模型 IBD的最佳表征模型之一就是CD4+ CD45RBHighT細胞移植建立的小鼠慢性結腸炎模型[44]，這一模型的發(fā)現(xiàn)使小鼠腸道炎癥的發(fā)展研究向前邁出了重要的一步。其核心原理是采用細胞分選技術從供體小鼠的脾臟中分離高濃度的CD4+ CD45RBHighT細胞，移植到同基因型的免疫缺陷SCID或RAG-1-/-小鼠體內，5～10周后即可引起受體小鼠出現(xiàn)消耗性疾病表現(xiàn)和結腸的彌漫炎癥，發(fā)病時間快慢和程度取決于當地動物飼養(yǎng)條件中的菌群分布情況[45]。劉占舉[46]從SCID小鼠脾臟磁珠分離CD4+ CD45RBHighT細胞并移植給同基因型的SCID小鼠，結果發(fā)現(xiàn)3～5周小鼠開始出現(xiàn)體重下降、6～8周出現(xiàn)慢性結腸炎表現(xiàn)，如腹瀉、便血等，組織學表現(xiàn)為大量淋巴細胞浸潤、黏液層破壞、IEC丟失、隱窩膿腫等，但炎癥細胞浸潤程度不夠確定，有時炎癥可發(fā)生在整個黏膜層并伴有肉芽腫形成，因此本方法建立的結腸炎模型有時可能會更偏向CD。

研究發(fā)現(xiàn)主要產生IL-10的調節(jié)性T細胞，與致病性CD4+ CD45RBHighT細胞一起移植時，作為重組IL-10或轉化生長因子-β的全身給藥，可以預防腸道炎癥和抗原特異性免疫應答的發(fā)生，因此學者認為IL-10和轉化生長因子-β是該模型中的抗炎因子[47]。

2.2IL-10基因敲除模型 IL-10是Th1細胞抑制因子，也是巨噬細胞的效應因子。體外研究已經表明，IL-10能抑制IL-12和腫瘤壞死因子-α的產生，抑制共刺激分子B.7.1和B.7.2表達，抑制T細胞增殖，并能促進抗原特異性調節(jié)性T細胞形成[48]。靶向缺失IL-10基因的小鼠，能夠自發(fā)形成慢性結腸炎模型，形成以Th1免疫應答為主的炎癥反應，同時組織學上，腸黏膜中可伴有大量淋巴細胞的浸潤、巨噬細胞和中性粒細胞的活化[49]。該模型主要用于研究以Th1反應為主的T細胞免疫機制或炎性因子的作用環(huán)節(jié)，但該方法建立的模型更趨向于CD。

有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10敲除模型在無菌環(huán)境下，不會形成結腸炎，而小鼠從無菌環(huán)境轉入普通或有菌環(huán)境，隨著環(huán)境中菌群的種類數量不同，引發(fā)的結腸炎程度不一致，這可能與結腸單核吞噬細胞中的MyD88缺乏有關[50]，因此有學者認為，IL-10缺失的模型對腸道菌群的研究更為有利。

2.3信號轉導與轉錄激活因子3基因敲除模型 小鼠巨噬細胞和中性粒細胞中信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的特異性敲除，會導致小鼠自發(fā)性的小腸、結腸炎，模型組織學表現(xiàn)可見透壁病變，以及結直腸癌的高發(fā)病率[51]。其機制可能與缺乏STAT3的巨噬細胞，在腸腔內食物或菌群抗原的刺激作用下引起的炎癥反應有關。

與STAT3密切相關的還有IL-22，二者共同構成IL-22/STAT3信號通路，急性結腸炎產生的IL-22可以介導STAT3促進上皮細胞修復的功能[52]。有研究發(fā)現(xiàn)，在緩解期UC腸黏膜中，細胞因子信號抑制蛋白-3可以反向抑制STAT3的表達，從而抑制IL-22/STAT3信號通路，阻礙腸上皮修復，使UC增加復發(fā)的可能性[53]，因此該研究反證了STAT3敲除對腸上皮損傷從而導致結腸炎的間接影響。

2.4A20基因敲除模型 A20是一種泛素編輯分子，可抑制腫瘤壞死因子誘導的核因子-κB活性。在A20敲除的缺陷型小鼠中，由于A20缺陷，未能及時終止腫瘤壞死因子誘導的核因子-κB反應，導致自發(fā)性結腸炎和腫瘤性疾病的發(fā)生[45]。有學者通過將小鼠樹突細胞(dendritic cell, DC)中A20和上游的接頭分子MyD88特異性敲除，證實了A20可以同時抑制依賴于MyD88和不依賴MyD88的信號通路，分別導致T細胞亞群的擴增以及T細胞和DC的激活。且敲除A20的小鼠DC，可自發(fā)性的成為淋巴細胞依賴的結腸炎，并表現(xiàn)出血清陰性的強直性脊柱炎，與人類IBD，特別是UC的腸外表現(xiàn)比較接近[54]。

2.5多重耐藥1a基因敲除模型 嚙齒類動物的多重耐藥(multidrug resistance, MDR)基因主要有1a、1b和2三種基因型，MDR1a敲除的基因缺陷鼠，在菌群誘導下可發(fā)展成為自發(fā)性腸炎。人類的MDR基因位于第7號染色體(q21.1)上，能夠編碼P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)，同時也是IBD的易感位點。有研究發(fā)現(xiàn)，MDR1a缺陷鼠的發(fā)病可能與IEC破壞有關，而與淋巴細胞功能關系并不大，且該模型導致的P-gp表達和功能下降，與臨床中UC患者的特點相一致，因此認為該模型可能更適合開展結腸炎中P-gp的相關研究[55]。

2.6IL-7轉基因模型 IL-7是致病性CD4+的效應和記憶T細胞關鍵存活因子，致病性CD4+效應和T細胞主要存在于骨髓中，因此骨髓是IL-7主要來源。IL-7的轉基因模型小鼠，體內過表達IL-7，導致以Th1反應為主的自發(fā)性慢性結腸炎，其組織學表現(xiàn)與人類UC比較接近[56]。最新研究發(fā)現(xiàn)，N6-甲基腺苷能通過調控IL-7信號通路，維持T細胞穩(wěn)態(tài)從而緩解結腸炎，也證明了IL-7在結腸炎中的致病性作用[57]。

綜上所述，隨著越來越復雜的IBD模型的出現(xiàn)，研究人員可以根據每種模型不同的特點和優(yōu)勢選擇合適的動物模型去研究具體問題。雖然目前仍沒有某種單一的動物模型可以概括人類UC所有的致病原因和臨床特征，但不同模型的不同側重，有助于揭示UC的發(fā)病或加重機制。由于多數基因修飾的自發(fā)模型，其發(fā)病和嚴重程度在很大程度上取決于環(huán)境因素，導致研究存在較高的可變性。化學性方法誘導的急慢性UC模型，因其成本低、可控性和可重復性強，雖然只能反映UC的某個方面，但仍然是目前UC研究中最常用的方法。