細胞程序性死亡在血管平滑肌增殖中的研究進展

芮博文，顏 競，楊平珍

南方醫科大學珠江醫院 心血管內科，珠江醫院心臟中心實驗室，廣東廣州 510515

細胞會通過調節自身的存活或死亡維持自身穩態，這個過程被稱為細胞程序性死亡，如凋亡、自噬、焦亡、鐵凋亡等。凋亡是人們最早發現的一種細胞程序性死亡方式，是存在于細胞中的自毀機制。這個過程機體能清除衰老及異常細胞，并在維持很多細胞功能方面有重要作用。現有的研究發現凋亡與血管平滑肌相關疾病存在重要聯系[1]。自噬在細胞維持內穩態扮演著至關重要的作用，通過降解細胞內成分供細胞更新細胞器及蛋白[2]。近年來興起研究的熱點焦亡、鐵凋亡[3]在對細胞生存也起著至關重要的作用。細胞焦亡是一種調節細胞死亡的促炎性形式。研究發現焦亡在形態學、機械學和病理生理學上都不同于其他形式的細胞死亡，焦亡可能與動脈粥樣硬化等血管平滑肌相關疾病存在密切關系。鐵凋亡是一種非凋亡形式的細胞死亡，可由脂質活性氧的積累和質膜多不飽和脂肪酸的消耗，觸發鐵凋亡，導致細胞死亡[4-5]。現有的研究發現鐵凋亡在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)生命周期中存在重要的調控作用。

1 細胞凋亡及其在血管平滑肌增殖中的作用

細胞凋亡是第一種被人們發現的細胞程序死亡方式，也是公認的各種生命活動過程中的重要組成部分，廣泛存在于各種多細胞生物中。在形態學上對凋亡進行研究，目前已經鑒定出細胞凋亡過程中發生的各種形態變化。在細胞凋亡過程中，通過光鏡可以看到細胞典型的收縮和萎縮現象[6]。凋亡作為一種獨特、重要的程序性細胞死亡模式，涉及到基因決定的細胞清除，其發展過程受到許多基因調控，如廣為人知的Bcl-2家族[7]、Caspase家族、抑癌基因p53等。人們通過對細胞凋亡的研究，對其機制有了一定的了解，目前仍有許多發現補充完善凋亡的機制。

研究發現凋亡在調節VSMC增殖中起重要作用。正常狀態下VSMC的增殖和凋亡保持平衡以維持細胞的數量，在外界刺激等因素打破平衡后，將會導致血管平滑肌細胞的異常增殖或死亡，造成病變的發展。在病變早期階段，凋亡受到抑制，血管平滑肌的增殖將造成冠狀動脈粥樣硬化、血管再狹窄等現象的發生[8]；但病變晚期，斑塊中血管平滑肌細胞產生分泌膠原蛋白可以提高斑塊的強度，對斑塊的穩定性是有益的和必要的，細胞凋亡會造成VSMC減少，導致斑塊的不穩定及鈣化發生[9]。

近年來的研究發現生物節律、ncRNA等可調節凋亡對血管平滑肌增殖中的作用[10]。一方面，研究發現miR-96-5p過表達靶向調節NFAT5促進血管平滑肌細胞的凋亡從而抑制AngⅡ誘導的VSMC增殖[11]；Wang等[12]發現lncRNA FOXC2-AS1通過miR-1253/FOXF1信號軸促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，加快了動脈粥樣硬化的發展。另一方面，Chen等[13]的研究發現環境污染物——丙烯醛通過lncRNA NEAT1和Bmal1/Clock的下調誘導VSMC凋亡，而蘆筍提取物減輕了丙烯醛引起的促凋亡反應和晝夜節律紊亂，達到穩定粥樣硬化斑塊的作用；褪黑素是一種調節時差、促進睡眠等多種功能的激素，Lee等[14]的研究發現褪黑素通過Sestrin介導的抑制mTORC1和ROS清除作用來控制VSMC的增殖和凋亡，達到穩定斑塊的作用。因此探究在VSMC增殖中，生物節律、ncRNA等調節細胞凋亡的作用機制，不同時期凋亡在血管平滑肌增殖中對病變組織轉化、效果及疾病預后的研究仍極有意義。

2 自噬及自噬流對血管平滑肌增殖的意義

2.1 自噬及其對血管平滑肌增殖的作用 自噬是一個通稱，是指所有通過將細胞質物質輸送到動物細胞的溶酶體或植物和酵母細胞的液泡中的途徑[15-16]。自噬作為維持細胞內環境穩定的重要機制在真核生物中廣泛存在并發揮了不可替代的生理作用。在自噬發生過程中有多種蛋白參與，包括 Atg[17]、LC3、P62[18]等，其中 LC3(light chain 3)是目前公認的自噬標志物，LC3蛋白經合成修飾后形成LC3-Ⅱ并緊密結合于自噬體膜上；P62/SQSTM1蛋白是公認的自噬相關蛋白，其可以將細胞質的成分標記，進入自噬體中進行降解[18]。因此P62蛋白也是評估自噬水平的重要指標之一，通過綜合分析這些蛋白的表達即可評估自噬流的通暢程度。

在生理狀態下，自噬可以有效抑制血管平滑肌細胞增殖，而病理狀態下自噬過度激活及水平不足均會導致血管平滑肌的異常增殖。通過研究發現自噬對血管平滑肌存在兩種截然相反的作用：1)自噬抑制血管平滑肌細胞增殖，通過將人肺動脈血管平滑肌細胞的LC3B基因敲除后，經缺氧處理可見平滑肌增殖增加，從而證實了自噬在其中發揮了保護性作用[19]；2)自噬促進血管平滑肌細胞增殖，文獻報道當外界刺激時VSMC自噬提高，自噬水平的提高加速了蛋白質和細胞內細胞器降解的速度，加速了血管平滑肌表型轉換及增殖的發生，促進動脈粥樣硬化[20-21]，而通過抑制自噬可阻止TNF-α誘導的表型轉換[22]。越來越多的證據表明，在許多病理狀態下血管平滑肌受細胞因子(如PDGF、TGF-β等)刺激由收縮表型轉換為分泌表型，其中分泌表型具有較強的增殖遷移能力，易導致血管狹窄，順應性下降，而在這些發展過程中通常可以觀察到細胞內自噬水平的改變。

2.2 自噬流在血管平滑肌增殖中的作用 既往的研究中往往從自噬體的水平對自噬的評價，但單從自噬體角度并不能反映自噬水平；自噬作為一個動態變化的過程，其包括了自噬體的誘導、形成、運送以及降解，我們將這自噬發展的整個過程稱為自噬流。從自噬流角度分析，自噬水平的評價應包括自噬體的形成和清除，即除了對自噬體進行檢測還應包括對自噬流的通暢程度進行檢測[23]。目前對自噬流及其通暢程度的研究多集中于腫瘤細胞、神經細胞及心肌細胞等細胞中，在這些研究中發現自噬流的通暢對維持細胞內環境穩定及其生理狀態起到至關重要的作用。

結合目前的研究，自噬流的通暢將是以后研究的方向之一[24]。Yin等[25]對以往神經細胞的研究總結發現自噬流的通暢對細胞正常狀態保護極為重要；在血管平滑肌中的研究目前主要涉及到血管的鈣化，研究顯示當自噬流不通暢時，可見血管鈣化明顯增強；改善血管平滑肌細胞自噬流的阻塞狀態可以抑制高糖環境導致的血管鈣化[26]。但目前自噬流與血管平滑肌細胞增殖的研究較為缺乏，可以作為今后的研究方向。

目前研究對血管平滑肌增殖模型的建立多采用PDGF[27]、AngⅡ[28]等處理細胞。PDGF-BB誘導血管平滑肌細胞自噬增強，促進細胞發生表型轉換、增強了細胞增殖及遷移能力，而細胞經PDGF-BB及自噬抑制劑共處理后可明顯抑制血管平滑肌增殖[29]。當采用AngⅡ構造VSMC增殖模型時，研究表明其激活了細胞內多條信號通路且在實驗過程中可以觀察到AngⅡ刺激后LC3-Ⅱ表達升高、P62蛋白降解。對于AngⅡ對自噬的作用機制，當下有實驗證據表明AngⅡ可能通過激活ROS來激活自噬[30]。結合以前研究表明AngⅡ促進血管平滑肌增殖的機制中就包括氧化應激，這與AngⅡ誘導自噬相互印證。

3 細胞焦亡及其對血管平滑肌增殖的作用

細胞焦亡也叫細胞炎性壞死，是一種程序性細胞死亡，作為近年來新發現的一種細胞程序性死亡方式[31-33]，是機體的一種重要的天然免疫反應，備受關注。研究發現細胞焦亡的分子生物學特征是由Gasdermin D介導的細胞程序性壞死，可分為依賴半胱天冬酶-1(Caspase-1)的經典途徑及半胱天冬酶-4、5、11(Caspase-4，5，11)的非經典途徑[34-35]。最新的研究發現Caspase-8也可以裂解并激活Gasdermin D，從而誘導細胞焦亡[36-38]。細胞焦亡的形態學特征、發生及調控機制等均不同于凋亡、壞死等其他細胞死亡方式，細胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經系統相關疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發生發展。

許多研究發現可以通過細胞焦亡抑制各種癌細胞的增殖和遷移[39]。目前對血管平滑肌細胞焦亡的研究較少，Li等[40]研究發現VX-765通過抑制Caspase-1，抑制VSMC在動脈粥樣硬化形成過程中的焦亡作用從而穩定斑塊。這提示細胞焦亡可以影響血管平滑肌狀態，PCI術后再狹窄的發生中炎癥反應誘導了血管平滑肌細胞增殖及遷移，而細胞焦亡作為細胞死亡的炎癥反應之一，推測細胞焦亡與血管平滑肌細胞的增殖有一定聯系，探究細胞焦亡與血管平滑肌細胞增殖的關系也是今后的研究方向之一。

4 鐵凋亡對血管平滑肌增殖的調節

鐵凋亡是近年來發現的一種由鐵依賴的氧化損傷引起的細胞死亡模式，是近年來發現的一種細胞凋亡的調節形式[41-42]。其形態學特征是細胞質和脂質活性氧增多、存在比正常線粒體小的線粒體、線粒體膜密度濃縮、線粒體嵴減少或消失、外線粒體膜破裂等。目前的研究表明Erastin[43]、RSL3、RSL5[44]、Buthioninesulfoximine[44]等 多 種化合物可以誘導鐵凋亡的發生。綜合目前的研究，許多的證據指出鐵代謝和脂質過氧化信號是鐵凋亡的中心環節，當細胞內谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)直接或間接受到谷胱甘肽(GSH)水平降低的抑制時，導致鐵依賴性脂質過氧化的累積，并最終導致鐵凋亡的發生[45]。過量的鐵離子可以通過Fenton反應產生ROS，進而誘導鐵凋亡的發生；通過研究發現鐵螯合劑(去鐵胺、甲磺酸去鐵氧胺、環吡酮奧拉明)通過降低鐵過載可以抑制Erastin介導的鐵凋亡[43]；當額外的外源性鐵源(如檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵等)則可以促進Erastin誘導的死亡[46]。在白血病細胞的研究中發現JNK和p38對Erastin誘導的細胞死亡也起到了重要作用，SP600125(JNK磷酸化抑制劑)和SB202190(p38活化抑制劑)可以抑制Erastin誘導的鐵凋亡[47]。

當前對鐵凋亡在血管平滑肌中作用的研究較少，根據已有的研究，香煙煙霧提取物以劑量和時間依賴的方式誘導血管平滑肌細胞死亡，通過特異性的鐵離子抑制劑或鐵離子螯合劑完全消除，進一步研究表明胞內谷胱甘肽的耗竭是誘導血管平滑肌細胞鐵凋亡的主要原因之一[48]。該研究表明鐵凋亡過程不僅存在于腫瘤細胞、心肌細胞、神經細胞，在血管平滑肌細胞中也存在，并且對疾病的發生及轉歸有重要影響。

5 展望

目前對血管平滑肌增殖的研究中，與凋亡相關的研究有一定的基礎，但凋亡的發展與調控仍具有較多疑問，而且凋亡程度在疾病發生過程中的動態變化及對疾病的影響仍然不明確，因此對細胞凋亡的研究仍然有意義。而目前涉及自噬、焦亡、鐵凋亡的相關研究較少。當前研究發現自噬與血管平滑肌細胞的關系是復雜的，自噬既可以抑制又可以促進血管平滑肌細胞增殖。現有的研究結果顯示自噬底物及觸發條件的不同，導致的生物學效應也不同；自噬的調節機制、如何誘導細胞選擇性自噬達到抗增殖的目的都需進一步研究。現在自噬流在其他細胞中作用的相關研究啟發我們從自噬流角度動態進行研究。結合以往研究中自噬的雙重效應，提示在抗增殖作用中自噬流的通暢程度也許更為重要。而調節自噬流的具體機制及對血管平滑肌細胞的具體影響需要進一步研究。細胞焦亡作為一種細胞炎性死亡方式，廣泛存在于各種細胞中。深入研究凋亡的信號機制，目前主要為Caspase-1的經典途徑及Caspase-4、5、11的非經典途徑，促進細胞死亡，抑制細胞增殖及遷移能力，但目前焦亡在血管平滑肌細胞中的研究較少，具有進一步研究的價值。鐵凋亡作為新發現的一種細胞凋亡過程，具有重要意義；鐵凋亡通過鐵代謝、脂質過氧化、MAPKs家族蛋白(ERK、p38和JNK)調節，在血管平滑肌相關疾病的發生、脂質代謝異常、MAPKs蛋白的激活中起著重要作用，這提示著我們鐵凋亡也許在這些疾病中起到了重要的作用，鐵凋亡在動脈粥樣硬化、血管再狹窄等疾病中的作用有較高的研究價值。血管平滑肌細胞中這些細胞程序性死亡之間的相互作用，缺乏研究證據，深入研究將更好地闡述各細胞程序性死亡與血管平滑肌細胞增殖的關系，為臨床治療提供新的指導意見。