非洲豬瘟病毒熒光定量PCR 檢測中的常見問題

潘慧芳

（清遠市動物疫病預防控制中心 511500）

非洲豬瘟 （African swine fever，ASF） 是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。 該病病程短，死亡率高，對養豬業危害甚大，世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病之一，我國將其列為一類動物疫病。ASFV 可感染家豬、野豬和軟蜱，是唯一一種節肢動物作為傳播媒介的DNA 病毒。 家豬感染后的臨床表現和病理變化以及流行病學特點類似于急性豬瘟，但更為急劇，以全身出血、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征，致死率高達100%[1]。2018 年8 月，遼寧省沈陽市確診我國首例非洲豬瘟，至今全國所有省份都已出現非洲豬瘟疫情[2],對我國養豬業造成了巨大的經濟損失。

目前， 各級獸醫實驗室主要采用熒光定量PCR 開展ASFV檢測工作。 但在日常工作中，常常出現假陽性、陽性對照或陽性樣品不顯示Ct 值和檢測樣品無典型“S”形擴增曲線但其Ct 值顯示為陽性等問題。 筆者通過查閱大量文獻以及結合平時的工作經驗，分析了上述問題的可能原因和解決方案。

1 熒光定量PCR 檢測假陽性的原因與預防措施

據文獻報道[3]，出現假陽性的主要原因有實驗室檢測功能區域設置不合理、檢測人員、物品流向不合理、實驗人員在核酸提取與試劑配制時未在獨立的生物安全柜中進行、 實驗人員操作不規范以及實驗結束后清潔消毒不徹底等。 針對上述問題，應從實驗室布局、檢測人員自身和實驗室生物安全方面進行改進。

1.1 完善實驗室功能分區

從事分子生物學檢測活動，微量的核酸污染即可嚴重影響試驗結果的準確性。 在設計分子生物學實驗室時，必須按照分子生物學試驗的具體要求，將實驗室嚴格分隔成試劑配制區、核酸提取區、 核酸擴增區、PCR 產物分析區等完全獨立的功能室，做到對互不相容活動的相鄰試驗區域形成真正有效的隔離， 防止交叉污染的發生[3]。

1.2 檢測人員正確規范操作

從事熒光定量PCR 試驗的檢測人員，必須經培訓合格后上崗，切實掌握PCR 檢測操作原理、方法和步驟，嚴格按照實驗室建立的檢測操作規程和試劑盒操作說明書進行各項實驗活動。所有ASFV 檢測的操作步驟必須在生物安全柜或者負壓實驗室進行處理，處理完畢之后，對操作臺面和房間進行徹底消毒。 試驗人員進入各個操作區域后，要嚴格單向移動，即試劑配制區→樣品提取區→核酸擴增區→產物分析區，不得逆行。

PCR 擴增完成后， 盡量避免打開密封反應體系。 禁止把PCR 產物帶到配制PCR 體系的區域內， 同時禁止在配制PCR反應體系的區域內，操作含核酸或質粒的溶液[3]。

1.3 做好實驗室生物安全

熒光PCR 試驗完畢后，必須對實驗室環境徹底消毒。 生物安全柜和潔凈工作臺進行紫外照射消毒， 時間不低于30min，以破壞殘留的核酸； 工作臺面等用10%次氯酸或75%酒精等消毒液消毒；實驗室內的樣本液和擴增產物是氣溶膠的主要污染源，故實驗室要經常換氣和消毒；所有試驗區域，包括懸掛白大褂位置、放置高速離心機位置、放置PCR 儀等區域都要用可移動紫外線燈照射30min[2]。

2 熒光定量PCR 的Ct 值和熒光擴增曲線異常

在熒光定量PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR 反應的進行， PCR 反應產物不斷累計， 熒光信號強度也等比例增加。 每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化， 從而得到熒光擴增曲線。 把PCR 反應的前6 個循環的熒光信號作為熒光本底信號， 熒光閾值的默認設置是2～6 個循環本底熒光信號平均值的12 倍。 樣品的熒光強度超過背景熒光值（熒光閾值）的時刻所對應的循環數，叫做Ct 值。

2.1 陽性對照或陽性樣品不顯示Ct 值及解決方案

日常檢測非洲豬瘟樣品時，常常出現陽性對照有典型的“S”型擴增曲線，但不顯示Ct 值（Ct 值顯示為Undetermined）。 有學者指出[4]，出現這種情況的主要原因是儀器默認的熒光閾值線過高。 解決方案：將熒光閾值一般設在PCR 指數擴增的起始，并高于陰性對照曲線。 其數值選擇與試劑盒的性能有關，對熒光強度較高的擴增曲線， 閾值的設定不一定非要遵循固定的原則。 因此，針對試劑盒性能不同，實驗室應建立自己的閾值范圍，盡可能保證低值樣本檢測結果的穩定性[4]。

2.2 檢測樣品無典型“S”形擴增曲線，但其Ct 值顯示為陽性及解決方案

實際檢測過程中，也會遇到被檢樣品無典型“S”形擴增曲線，但其Ct 值顯示為陽性（按照試劑盒說明書Ct 值判定標準）的情況。其他學者發現， 主要是被檢樣品不夠新鮮或經反復凍融等導致的。 因此，被檢樣品要盡量新鮮，4℃～8℃保存的血清或抗凝血樣品一般不超過120 h，唾液樣品、組織樣品凍融次數一般不超過3 次[4]。