CRISPR/Cas系統在活細胞染色體成像中的應用

袁 曦 陳 群 何 倩 于冬梅 秦培武

摘? ? 要：CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins）是細菌抵抗外來入侵的一種自適應免疫機制，利用CRISPR/Cas9系統可實現雙鏈DNA的剪切并誘導宿主細胞DNA修復機制，從而達到靶向編輯基因的目的。核酸酶失活的Cas9（Nuclease-deactivated Cas9，dCas9）耦聯效應分子可以調控靶標結合位點附近基因的表達、表觀遺傳修飾及特異染色體區域標記。目前已開發出多種CRISPR/Cas9系統，可對活細胞中重復或低重復序列基因位點進行實時多位點同步成像，廣泛應用于動物和植物細胞中。基于CRISPR/Cas系統的活細胞染色體成像技術為研究活細胞染色體動力學和三維染色體結構提供了全新角度。本研究針對CRISPR/Cas系統的生源機制及其在活細胞成像的應用和發展現狀進行概述，以期為該領域的相關研究提供參考。

關鍵詞：CRISPR/Cas系統;活細胞;染色體;成像

中圖分類號：Q789? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.002

Application of CRISPR/Cas9 System in Living Cell Imaging

YUAN Xi， CHEN Qun， HE Qian， YU Dongmei， QIN Peiwu

（Center of Precision Medicine and Healthcare， Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute， Shenzhen， Guangdong 510855， China）

Abstract： CRISPR/Cas is a bacterial adaptive immune system. By cleaving specific strands of DNA and inducing DNA repair mechanism in host cells through CRISPR/Cas9 system， genome editing can be achieved. Nuclease-deactivated Cas9 （dCas9） can regulate gene expression， epigenetic modification， and label specific chromosomal regions via coupling effectors. Diverse CRISPR/Cas9 systems can target either the repetitive or low repetitive chromosome loci for live cell visualization， which is applicable to both animal and plant cells. Live cell chromosome imaging based on CRISPR/Cas system provides a new perspective for studying chromosome dynamics and three-dimensional genome structure. This review summarized the recent progress on the study of the molecular mechanism of CRISPR/Cas system and its application in living cell imaging.

Key words： CRISPR/Cas system; living cell; chromatin; imaging

1 CRISPR/Cas技術的作用原理

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是自然界中細菌抵御病毒侵染而進化產生的一種天然免疫系統，自2012年起被廣泛應用于基因編輯研究中[1]。CRISPR/Cas（CRISPR-associated Proteins）系統在微生物中具備豐富的遺傳多樣性，已經發現的CRISPR/Cas系統可分為兩大類，包括6種主要類型和33種亞型 [2]。每種CRISPR-Cas系統的組成結構各具特點，當前應用最廣泛的是化膿性鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9）[3]。近年來，CRISPR/Cas系統在靶向基因編輯、基因激活和抑制、表觀遺傳修飾、全基因組篩選、RNA病毒檢測和活細胞染色體成像等領域取得了一系列突破性進展[4-6]。

Cas9的免疫作用機制如圖1所示：細菌初次被來自噬菌體或病毒的外源DNA侵染時，其CRISPR系統中的Cas1和Cas2酶識別并切割部分外源DNA中被稱為間隔區（Spacer）的DNA片段，并將其整合插入細菌DNA的回文重復序列（Palindromic Repeats）之間，從而獲取間隔區;當細菌再次被相同的外源病毒DNA侵染時，宿主DNA會轉錄pre-crRNA（precursor-CRISPR RNA），隨后被切割成多個guide RNA（gRNA）。gRNA由crRNA（CRISPR RNA）和反式激活RNA（Trans-activating CRISPR RNA，TracrRNA）組成。crRNA中的spacer序列可與靶標DNA的一條鏈堿基互補配對，tracrRNA與crRNA的CRISPR重復區域（Repeats）堿基配對連接形成具有發卡結構的gRNA，從而把這2個RNA融合形成單鏈的sgRNA（single guide RNA，sgRNA）。gRNA與Cas9結合后，crRNA搜索入侵病毒基因組DNA中能夠與其互補配對的位點;Cas9識別PAM（Protospacer-Adjacent Motif）位點并錨定相應區域，再通過Cas9核酸酶切割病毒DNA，從而實現阻礙病毒的入侵[7]。

CRISPR/Cas利用這種簡單高效的識別系統，精準靶向某一特定DNA片段并進行切割，切割后的雙鏈DNA在細胞內可以通過兩種方式修復，一種是非同源末端連接修復途徑（Non-Homologous End Joining Repair Pathway，NHEJ），NHEJ容易引起切割位點附近發生隨機插入或者刪除，從而破壞靶基因的正常表達;另外一種是同源定向修復途徑（Homology Directed Repair Pathway，HDR），利用同源重組機制中可將目標DNA片段整合到宿主基因組中。相比之前的基因編輯工具，如鋅指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）和轉錄激活因子樣效應核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN），CRISPR/Cas9系統不需要進行繁雜的人工蛋白改造，只需設計相應的gRNA即可實現精準定位并切割靶標DNA，CRISPR/Cas基因組編輯系統的操作更加簡單靈活、成本更低、特異性更高、識別范圍更廣[8]。

CRISPR核酸內切酶的相關研究一直在快速發展，從較小核酸內切酶到經過修飾的核酸內切酶，性質各樣的核酸內切酶使CRISPR系統基因組編輯功能更加強大。CRISPR/Cas9編輯基因是永久性的，對一些應用而言并不理想。因此，研究者們對Cas9內切酶核心區域進行點突變，使dCas9（Nuclease-deactivated Cas9）喪失剪切DNA的內切酶活力，但仍保留dCas9靶向特定DNA序列的能力[9]。利用dCas9與轉錄調節因子融合，能夠實現可逆地調節基因表達，在轉錄水平上激活或抑制非編碼RNA（Non-coding RNA， ncRNA）、天然反義轉錄產物（Natural Antisense Transcript， NAT）或MicroRNA的表達。下面分別介紹dCas9在轉錄調控、表觀遺傳修飾、細胞染色體成像方面的應用概況。

2 CRISPR/dCas9在基因轉錄調控中的應用

CRISPR/dCas9可通過與轉錄激活因子或者抑制因子融合實現對靶向基因的表達調控，其中dCas9-SAM（dCas9-Synergistic Activation Mediator）系統通過募集轉錄激活因子來調節靶基因表達。如dCas9與轉錄調控因子（如VP64和p65）融合，通過sgRNA靶向內源啟動子實現轉錄因子增強基因表達[10]。當dCas9與轉錄抑制因子KRAB（Krüppel Associated Box）融合時，募集組蛋白促進異染色質形成，可實現可逆抑制基因表達5～10倍。與依賴于細胞質中mRNA降解來進行基因抑制的RNA干擾機制不同，dCas9-KRAB能夠在DNA水平上進行轉錄抑制，可用于ncRNAs、microRNAs、核定位RNA的轉錄抑制，擴展和提高了非mRNA研究手段[11]。

表觀遺傳修飾是一系列針對遺傳物質的精準化學修飾，其可在不改變DNA序列的情況下導致特定基因選擇性沉默或活化。DNA甲基化及組蛋白修飾（例如甲基化、乙酰化）調節特定基因組區域是否被解壓縮且可被RNA聚合酶II接近，或者它是否被緊密地捆綁成轉錄沉默的異染色質。表觀遺傳修飾作為基因表達調控的第二級，是可遺傳和可逆的。CRISPR/dCas9技術的出現為表觀遺傳學研究提供新的途徑。將不同的效應物連接到dCas9系統上，可實現表觀遺傳修飾改變，如組蛋白乙酰轉移酶p300與dCas9融合能夠使特異靶DNA序列附近的組蛋白乙酰化，從而激活基因表達;而dCas9與去甲基化酶LSD1（Lysine-Specific Histone Demethylase 1A）融合能使靶序列附近的組蛋白去甲基化[12]。

3 CRISPR/dCas系統在活細胞染色體成像中的應用

Chen等[13]于2013年首次報道了使用dCas9進行染色體成像的相關研究，目前CRISPR/dCas系統已是活細胞染色體成像研究的一項重要工具。Web of Science數據庫檢索發現，2016—2017年該主題文獻年出版數量快速增加，出版文獻年引用頻次也逐年遞增。這表明，近年來利用CRISPR/dCas系統進行活細胞染色體成像逐漸得到了研究者們的密切

關注（圖2）。

dCas9與eGFP（enhanced Green Fluorescent Protein，eGFP）融合表達后，dCas9-eGFP復合體與sgRNA在細胞內組裝成有功能的復合體，待復合體結合到靶標DNA后，可通過熒光顯微鏡對活細胞中端粒等高重復染色體區域進行動態觀察。在非重復基因座上靶向36～73個sgRNA，該系統能夠觀測到MUC4基因座內的非重復基因組區域。為實現多個gRNA的復用并將數十個不同的gRNAs高效遞送到單細胞中，Gu等 [14]擴展了dCas9-eGFP成像方法，開發了一種稱為嵌合gRNA寡核苷酸陣列（Chimeric Array of gRNA Oligonucleotides，CARGO）的技術。CARGO技術將幾十個不同的gRNAs組成陣列遞送到單細胞中，從而精確識別獨特的非重復DNA片段，再利用多種熒光分子對其進行標記，實現了對特異DNA片段的動態觀測。利用該技術，Gu等[14]定量地測定了胚胎干細胞中發生分化相關活性的增強子和啟動子的運動變化情況。

由于dCas9蛋白傾向定位在核仁中，dCas9-eGFP方法在核仁中會引發較高的背景信號。為了增強熒光信號強度和提升信噪比，可用更多的熒光蛋白（Fluorescent Protein，FP）分子標記dCas9，例如通過使用超新星標記系統（Sun-Tag），即利用一般對照不可誘導4號（General Control Non-Inducible 4，GCN4）肽序列與特異納米抗體之間相互作用募集多個FP[15]。利用dCas9-SunTag可以實現僅用20種不同的sgRNA就能連續跟蹤MUC4基因的非重復區域[16- 17]。

上述方法是針對改造過的dCas9與熒光蛋白融合進行基因組成像，另外一種可替代方式是使用修飾的sgRNA對基因組位點進行成像。這些經修飾的sgRNA可以募集與FP融合的序列特異性RNA結合蛋白。例如經修飾、包含多個重復RNA適配體的sgRNA，這些適配體可以特異性結合其同源結合蛋白（Cognate Binding Protein，CBP）。最廣泛使用的RNA適配體是MS2，一種源自噬菌體MS2的RNA莖環結構，其可以特異性結合MS2外殼蛋白（MS2 Coat Protein，MCP）。Qin等[18]的研究表明，基于MS2的系統可以用單個sgRNA對低重復序列位點進行成像，增加MS2片段的重復次數，可顯著提高信噪比和靈敏度。使用4個序列特異sgRNA，每個含有16個MS2適體，對低重復序列區域進行標記后，使用晶格光片顯微鏡（Lattice Light Sheet Microscopy，LLSM）可實現對細胞周期中天然染色質基因座的跟蹤，并確定差異轉錄活性和非活性區域在細胞核中的定位。上述研究結果表明，MS2修飾的sgRNA方法可有效地監測活細胞中重復和非重復基因組區域的位置和動態。

此外，將CRISPR-dCas9和Pumilio RNA結合蛋白相結合建立的Casilio系統，也可用于活細胞基因組位點的標記[19]。Pumilio和Fem3 mRNA結合因子（Fem3 mRNA-Binding Factor，FBF）蛋白共享保守的Pumilio/FBF（PUF）RNA結合結構域，該結構域可通過設計用以結合特定的8聚體RNA序列（PUF-binding site，PBS）。Cheng等[19]通過設計sgTelomere和sgCentromere，使其分別攜帶多個PUF結合位點，并將dCas9和Clover-PUF/sgCentromere-20×PBS及Ruby-PUF/sgTelomere-25×PBS在HEK293細胞內共表達，成功實現了在同一細胞內同時對染色體端粒和中心粒進行成像觀察。

4 CASFISH及CRISPR/dCas9與DNA FISH結合在染色體成像中的應用

熒光原位雜交（Fluorescencein Situ Fybridization，

FISH）技術是利用與熒光基團耦合的核苷酸作為探針，在細胞內與相應的靶DNA或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號而對組織、細胞或染色體上DNA或RNA進行定性或定位分析的一種技術[20]（圖3）。FISH迄今已發展了30多年，其在識別DNA和RNA序列方面具有高度敏感性和特異性，并且能在單細胞水平上同時對多個染色體位點進行可視化追蹤[21]，因此在解決單個染色體或整個基因組的結構、突變和進化等有關方面得到了廣泛應用[22]。但由于DNA FISH需要經過甲酰胺和熱處理使DNA變性以便于與熒光核酸探針進行雜交，該過程可能會對生物體結構和基因組織的完整性造成破壞，無法準確的反映其原有空間結構[23]。CASFISH（Cas9-mediated FISH）利用CRISPR/Cas9復合物具有識別特異靶DNA的特性來標記序列特異性的染色體位點[24]，DNA不需要經過變性處理，有利于保留細胞形態和基因組結構。CASFISH既可對含有高重復序列的染色體位點進行標記，也可通過使用多個sgRNA將Cas9-熒光蛋白復合物靶向目標位點，從而標記非重復染色體位點。不同熒光標記的dCas9/sgRNA還可對細胞中的多個染色體位點進行同步多色標記，以便于研究多個染色體位點之間的空間關系。由于CASFISH是利用dCas9介導的酶促反應對特定序列進行標記，在優化條件下15 min內即可完成標記，相對DNA FISH方法更加快捷[24]。將dCas9與Halo標簽融合，形成的dCas-Halo可用于各種熒光染料標記[24-25]，再利用靶向不同DNA序列的sgRNA組合，可增加熒光染料選用的靈活性和多樣性，并降低開發靶向多重基因位點熒光探針的成本。

Takei等[26]和Guan等[27]提出了一種先跟蹤后識別（Track First and Identify Later）的策略，即將CRISPR/dCas系統和DNA Sequential FISH（seqFISH）相結合的方法來對活細胞內的多個染色體位點進行動態追蹤（圖4）。首先用CRISPR/dCas9系統對多個染色體位點進行單色實時成像。當動態記錄結束時再將細胞固定，連續多次使用DNA FISH來識別每個位點的身份。這一方法將染色體位點的動態追蹤任務和這些位點的獨特識別分離，將CRISPR標記和seqFISH兩者優勢相結合，實現了在單一顏色通道下對活細胞的多個染色體位點的動態追蹤。為了能夠在實時成像之后快速且連續的進行DNA FISH操作，Guan等[27]優化了FISH方法，使得整個染色過程能在1 min內完成，極大地縮短了試驗周期。每輪成像檢測后利用甲酰胺溶液洗滌以去除上一輪結合的DNA探針，避免連續多次FISH試驗中DNA探針信號之間的干擾。利用該方法可同時對7個染色體位點進行鑒定，DNA FISH經過20多輪的染色和洗滌后，仍能保持高強度的熒光信號和高效率的清洗效果[27]。這種將實時和固定成像聯合使用的方法同樣可用于RNA-FISH中對多個靶標RNA成像。

5 CRISPR/dCas系統在細胞染色體成像中的雙色標記

在活細胞中對染色體進行動態成像往往需要能夠同時觀測一個以上的基因位點，如研究表觀遺傳調控機制就涉及跟蹤兩個基因座染色質的相互作用。目前CRISPR/dCas9系統通過以下兩種策略對活細胞中的基因組進行雙色標記。

一種策略是將來自不同菌種的dCas9蛋白耦合不同熒光蛋白[28-29]（圖5A）。由于源自不同菌種的Cas9識別特定的PAMs序列且sgRNA骨架不同，彼此互不干擾，因此可以對不同基因組位點進行多色標記。除了化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes，SP）Cas9之外，來自腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitides，Nm）、嗜熱鏈球菌（Streptococus thermophiles，St1）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sa）等的Cas9蛋白可以任意組合實現多色CRISPR成像。利用不同熒光染料標記的dCas9-sgRNA可以確定不同染色體上基因座之間的核內距離或同一染色體上兩個基因座之間的空間距離[29]。與SPCas9相比，NmCas9和St1Cas9能識別更長的PAM序列，因此其靶向設計受到了一定限制。此外，熒光標記的dCas9蛋白體積較大，當將這些融合蛋白引入同一個真核細胞時，增加了轉染和病毒感染的難度。

另外一種策略是通過修飾sgRNA以實現基因組位點雙色成像（圖5B）。將RNA發夾結構引入sgRNA的3'末端，使sgRNA轉化為支架RNA（scaffold RNA，scRNA），當與dCas9共表達時，可以將與熒光蛋白融合的RNA結合蛋白募集到靶點以實現特異標記[30-32]。如Fu等[30]運用此方法在sgRNA的3'末端引入了MS2和PP7，生成的sgRNA-MS2 和sgRNA-PP7分別與MCP-EGFP和mCherry-PCP融合蛋白相結合，實現了以不同顏色同時標記主要和次要衛星區域以及同時標記小鼠染色體12上兩個單獨的基因位點。Shao等[32]的研究表明，此方法能夠長期同步對端粒和著絲粒的高重復區域進行穩定成像，并且基于sgRNA的標記方法比基于Cas9的標記方法更加耐受光漂白，這對于染色體動態的、連續的和長期的跟蹤更具優勢。此外，Zalatan等[33]基序可用于BFP融合的com蛋白識別，因此通過設計含有com基序的scRNA，可實現以不同顏色標記第三個基因座。通過修飾sgRNA實現基因組位點雙色成像的最大的優點在于，只使用一種dCas9蛋白即可實現染色體位點的多色標記。由于SPCas9的PAM位點（NGG，N代表任何堿基），廣泛存在于基因組中，其靶向設計較NmCas9、St1Cas9等更具靈活性。與基于熒光蛋白修飾不同來源的Cas9的成像系統相比，修飾sgRNA進行多色標記更具靈活性，但此方法需要設計更多的融合蛋白，使得細胞系的構建過程更加復雜。

6 CRISPR/dCas系統在細胞成像中的多色標記技術

在染色體動力學的研究中，往往需要同時對多個染色體位點進行特異性和差異性標記，但上述方法最多只能同時追蹤活細胞中的3個基因組位點，難以滿足研究需要。為解決這一問題，Ma等[34]于2016年開發了一種名為CRISPRainbow的技術來實現對基因組多基因座進行標記，這是一種通過設計sgRNA以結合不同熒光蛋白對特定基因位點成像的技術（圖6）。首先將發夾結構RNA（如MS2、PP7和boxB）連接到sgRNA的3'端或莖環上，這些特殊的發卡結構分別能被融合了不同熒光蛋白（BFP、RFP和GFP）的天然結合蛋白（如MCP、PCP和N22）所識別。因此，當sgRNA與兩個相同的熒光蛋白組合時，會產生3種基色（藍色、紅色和綠色）;當sgRNA分別與兩個不同的熒光蛋白組合時，3種基色兩兩疊加會產生青色（BFP+GFP）、品紅色（RFP+BFP）和黃色（GFP+RFP）;而當sgRNA同時與3種熒光蛋白組合時，3種基色疊加將得到白色。雙重雙色標記是通過sgRNA結合不同的熒光蛋白來實現的。這一技術能夠動態地對多個不同的染色體位點進行可視化觀察，目前已實現在活細胞中同時對6個染色體基因座同時成像[34]。與基于熒光蛋白修飾Cas9進行多色標記相比，CRISPRainbow只需利用SPCas9結合融合了不同熒光蛋白的sgRNA，標記顏色的范圍更容易拓展。理論上，再增加一種顏色，CRISPRainbow將能夠同時對15個基因組位點進行特異性的標記。但由于在該系統中對sgRNA進行了大量修飾，導致sgRNA的穩定性不佳，而sgRNA的穩定性是影響標記效率的重要因素[35]。

為此，Ma等[36]提出了一種名為CRISPR sgRNA-Sirius的方法來改善CRISPR成像系統的標記效率和靈敏度。首先，他們利用CRISPR-Broccoli系統[37]在活細胞中研究了在不同位點插入外源RNA對sgRNA穩定性的影響，發現外源RNA插入sgRNA的tetraloop比3'-末端更穩定[36]。然后通過進一步優化RNA適體的結構，設計出了3種CRISPR-Sirius結構（sgRNA-Sirus-8XMS2、CRISPR sgRNA-Sirius-8XPP7和CRISPR sgRNA-Sirius-4X（MS2-PP7）。該結構在保持靈活多色標記的基礎上，提高了在活細胞中追蹤DNA的靈敏度，實現了同時可視化同一染色體上的多個不同基因座位，并測量了不同基因座的空間距離、觀測了其動態行為。高效穩定的多色標記方法有望成為研究細胞周期進程、表觀遺傳調控期間或細胞刺激反應中染色體內和染色體間結構域動態相互作用的有力工具。

7 CRISPR/dCas系統在植物細胞成像中的應用

盡管CRISPR/dCas9系統于2013年就開始用于人體和哺乳動物細胞特定基因組位點的可視化研究[13]，但直到2017年Dreissig等[38]才首次將其應用于植物細胞成像研究。在2017年以前，CRISPR/Cas9系統在植物細胞中主要用于基因編輯和轉錄調控研究。Dreissig等[38]利用分別標記了eGFP和mRuby2的化膿性鏈球菌dCas9和金黃色葡萄球菌dCas9，觀測本塞姆氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉細胞，開展蛋白質-端粒相互作用動力學研究，揭示了端粒在細胞間期的動態運動規律。通過在葉片細胞中共同表達Sp-dCas9-mRuby、sgRNA-端粒和結合了GFP的端粒重復結合蛋白1（Telomeric Repeat Binding Protein 1，TRB1），研究者們還探討了染色體端粒的重復序列與TRB1結合比例之間的動態關系。基于CRISPR/dCas9系統的細胞成像技術有望發展成為研究植物細胞染色體動力學的重要技術。

8 展 望

盡管目前已開發出多種CRISPR/dCas9系統用于活細胞中重復或低重復序列基因組位點實時成像研究，但CRISPR/dCas9系統的靶向效率和成像靈敏度仍需進一步提高。CRISPR/dCas9系統的靶點主要受PAM序列的限制，若想實現更多基因組位點的同步精確成像，需進一步開發多樣化的Cas9系統與PAM識別位點，從而進一步擴大CRISPR/dCas9系統的可識別靶點范圍。例如，尋找具有特異PAM位點的Cas9，或通過基因工程手段有目的性的設計Cas9，開發擁有新PAM特異性的Cas9突變體。SpCas9的PAM序列在動植物基因組中廣泛存在，但其基因長度大于4 kb，增加了轉染和病毒感染的難度，研發小型的Cas9同源蛋白是發展其在細胞成像領域中應用的重要方向。此外，優化sgRNA的結構，設計更高效的sgRNA傳遞系統，有助于充分發揮該技術標記單拷貝基因的潛力。進一步提高CRISPR信號或使用高靈敏度的尖端顯微鏡，可進一步優化信噪比，也有利于進一步提高成像效率。高靈敏度和高效率的實時動態成像技術有望幫助解決諸多基因組和染色質領域研究的關鍵問題，CRISPR/dCas活細胞染色體成像技術的發展是解決這些問題的核心要義。

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收稿日期：2019-11-21

基金項目：國家自然科學基金（31970752）;Shenzhen Municipal Development and Reform Commission Subject Construction Project （[2017] 1434）;Shenzhen Municipal Development and Reform Commission， Shenzhen Engineering Laboratory for Precision Medicine and Healthcare（SDRC[2015] 1950）

作者簡介：袁曦 （1995—），女，重慶人，碩士，主要從事細胞成像方面的研究。

通訊作者簡介：秦培武（1979—），男，黑龍江人，助理教授，博士生導師，主要從事染色體結構與基因轉錄和細胞功能關系及熒光成像方法開發方面的研究工作。