手術中一種新的細胞治療方法——內皮祖細胞

李 潔 李 萍 閻春生 哈小琴

1963年，首次報道血液中可能存在內皮細胞，而后在心臟移植患者的冠狀動脈內壁發現了受體來源的內皮細胞，提示受體血液中的內皮細胞定居于移植物并參與血管壁的構建，再次證明移植物表面存在內皮細胞，而這些內皮細胞只可能來源于血液。1997年，Asahara等[1]首次證明循環外周血中存在能分化為血管內皮細胞的前體細胞,并稱之為血管內皮祖細胞。內皮祖細胞來源于骨髓,它們進入循環血,在血管移植物上分化為內皮細胞[2]。內皮祖細胞是在缺氧等病理條件下從骨髓中募集的，在缺血組織的新生血管形成中發揮至關重要的作用。目前已經建立了兩種主要的EPCs亞型：所謂的“早期”EPCs(隨后稱為早期EPCs)和后期衍生的EPCs(晚期EPCs)[3]。在體外培養過程中，根據其生物學特性和外觀可對其進行分類。“早期”EPCs出現在外周血來源的單核細胞在內皮細胞特異性培養基中培養后不到1周，而在2～3周后可以發現晚期的EPCs。晚期EPCs被認為主要是通過其分化成成熟內皮細胞的能力直接參與新生血管的形成，而早期EPCs將各種血管生成因子表達為內源性貨物，以旁分泌的方式促進血管生成，在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)過程中，各種因素控制EPCs向血管形成區域的歸巢。

EPCs在人血液中循環，具有分化為內皮細胞的能力，它們參與血管生成，能夠以各種方式將炎癥和缺血/再灌注損傷(I/R)造成的損害降到最低[4]。例如，EPCs顯示細胞內過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶或錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutases, MnSOD)等抗氧化酶水平升高。抗氧化應激能力的增強使EPCs能夠在缺血損傷后活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高的微環境中發揮作用。EPCs的數量可能與血管修復有關，循環EPCs數量的減少預示著心血管事件的發生。然而，EPCs的明確定義還沒有找到,到目前為止，EPCs還沒有特異性的細胞表面標記或一致的表型，這些細胞在外周血中非常罕見。另外，EPCs主要受HIF-1、VEGF、SDF等多種細胞因子的動員歸巢至特定部位并入血管內皮，受多種信號系統的調節進行分化完成血管新生[5]。各種治療手段亦會影響血EPCs水平的改變。研究不同治療手段對EPCs的影響不僅可以預測患者治療后的轉歸而且可以指導制定聯合治療策略，掌握不同治療手段對EPCs的不同影響，有助于權衡聯合治療方案。

一、內皮組細胞與經皮冠狀動脈介入治療術

EPCs在心血管系統和經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)術后冠狀動脈再狹窄的病理生理學中的作用是有爭議的。盡管研究描述了EPCs在動脈粥樣硬化過程中的保護作用，但在再狹窄中，EPCs、內皮修復和誘導新內膜增殖之間存在復雜的關系，因此，尚不清楚EPCs在這種情況下是否具有有益或有害的影響，有研究者為了探究經皮冠狀動脈介入治療支架置入術前后循環EPCs與冠狀動脈再狹窄和不良心血管事件的關系，在PCI術前及術后1天取靜脈血，通過流式細胞術進行免疫表型分析，總白細胞計數和EPCs鑒定[6]。結果表明，基線EPCs計數與年齡和冠狀動脈疾病的程度呈負相關，與另一項研究結果相似[7]。

而在這項研究中，約2/3的患者PCI術后EPCs計數下降，且EPCs計數與PCI術后預后無顯著相關性。這與其他研究描述的由于PCI導致內皮損傷進而致使EPCs動員從而使EPCs計數增加有所不同，而對于這些不同的結果，研究者也表明可以通過研究的EPCs亞群的差異以及PCI引起的血管損傷程度的差異來解釋[7]。EPCs的研究具有挑戰性，目前還沒有完全準確定義EPCs的標準，所以導致了EPCs不同亞群的鑒定。同時，內皮祖細胞的動員和功能受到心血管危險因素、伴隨疾病和PCI損傷內皮細胞數量的影響，而這些影響又難以控制，因此，需要繼續研究，以闡明EPCs在PCI術后再狹窄和預后中的作用。

二、內皮祖細胞與心臟手術

手術后外周血中EPCs的突增可能是多因素的，涉及氧化應激損傷、缺氧和炎性反應，手術后已知的用于募集EPCs的化學引誘物如MIF、CXCL12和CXCL8水平明顯增加[8]。當將這些發現轉化回體外實驗時，結果表明，在體外測量的生理濃度下，既沒有CXCL12也沒有CXCL8介導的EPCs遷移效應，使用所描述的EPCs分離模型和隨后的遷移測定，MIF被鑒定為EPCs遷移的主要介質。在這方面，實驗證明MIF和VEGF對缺氧條件下EPCs遷移的影響最大。但是，VEGF的測量顯示VEGF在術后的血液濃度中無顯著變化，這可能和部分手術中VEGF與肝素的結合有關。因此，MIF可能在心臟手術患者的EPCs募集中在血管生成趨化因子中起主導作用，并且可能通過將EPCs運輸到損傷部位來啟動并促進心肌缺血再灌注后的愈合過程。MIF水平在心肌缺血再灌注后立即增加，MIF介導的對EPCs募集的影響是否可能影響心臟重塑和血管生成仍然是推測，這對預防心肌缺血再灌注后的心力衰竭具有重要意義[9]。

三、內皮祖細胞與減肥手術

尚不清楚在肥胖癥中毛細血管密度或循環內皮祖細胞的數量是否減少，或者是否也存在小血管的纖維化。此外，從未評估過減輕重量對這些參數的可能影響。因此，一項研究調查了25例嚴重肥胖患者的EPCs和毛細血管密度，均進行了減肥手術，18例血壓正常的強壯(able-bodied)患者和12例高血壓強壯(able-bodied)患者作為對照。所有患者在減肥手術期間都接受了皮下脂肪活檢。在5例患者中，在腹部整形術的外科手術期間，約1年后持續減輕體重后獲得第2次活檢。肥胖導致EPCs和毛細血管密度降低，體重減輕后EPCs顯著增加，肥胖患者的血管膠原含量明顯增加。在血壓正常的肥胖患者和高血壓肥胖患者之間沒有觀察到血管膠原的顯著差異。在顯著減輕體重后，膠原蛋白含量幾乎正常化。在各組之間及減肥前后的應力應變關系均無差異。綜上所述，數據表明肥胖導致微血管稀疏，肥胖患者的EPCs明顯減少。減肥手術引起的顯著體重減輕似乎能顯著改善EPCs的數量，但不能改善毛細血管稀疏，無論血壓升高與否，肥胖患者都存在明顯的皮下小阻力動脈纖維化，持續的減肥手術可誘導微血管纖維化幾近恢復[10]。

四、內皮祖細胞與骨科手術

一項實驗在大鼠股骨截骨模型中評估了局部使用體外擴張EPCs對血管生成的刺激和骨折部位骨愈合的促進作用，根據放射學、組織學和顯微CT結果，EPCs治療組與對照組比較，局部EPCs治療可顯著促進大鼠股骨節段性骨缺損的骨再生。在一項類似的研究中，同一研究小組報道局部EPCs治療對生物力學穩定性有良好的影響[11]。有報道表明，外周血來源的EPCs有助于體外間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的成骨分化，而MSCs支持EPCs的增殖[12]。另外有實驗在體外共培養系統中研究了骨髓EPCs (BM-EPCs)與MSCs的相互作用，其數據表明，BM-EPCs和MSCs之間通過旁分泌和直接細胞接觸機制發生交聯，從而調節血管生成反應[13]。在大鼠模型研究中，觀察到EPCs與間充質干細胞之間的協同作用，并認為EPCs在新生血管形成的初始階段對完全骨再生至關重要，而EPCs治療的積極效果也已在韌帶組織再生中得到證實[14]。另有研究探討了局部移植的人外周血CD34+細胞對內側副韌帶損傷愈合的影響，與對照組比較，通過肉眼觀察，組織學和生物力學評估顯示CD34+細胞移植組的韌帶愈合顯著增強，推測循環人CD34+細胞的局部移植可通過新血管形成促進有利環境來增強韌帶愈合過程[15]。基于體外和動物模型EPCs研究的良好結果，臨床試驗開始。作為一項臨床試驗的試點病例，有研究報道了將自體外周血CD34+細胞移植到脛骨骨折不愈合患者體內的結果，骨折經細胞移植治療12周后實現臨床及影像學愈合，并且未發生嚴重的短期并發癥[16]。EPCs具有向內皮細胞分化、參與新血管構建等獨特功能，可塑性強，可為骨和韌帶組織工程提供治療方案。在不久的將來，可能會吸引更多的研究者來探索這些細胞在骨科手術中的潛力。

五、內皮祖細胞與腹腔鏡手術

癌癥的進展在很大程度上依賴于新生血管的形成，循環內皮祖細胞具有體外形成完整血管結構的能力，在腫瘤血管生成中發揮重要作用，手術損傷可導致動物模型中EPCs的動員，這可能對癌癥患者的預后產生負面影響。有實驗研究了20例接受開腹手術治療各種形式的腹部癌癥的患者，以及20例年齡和性別都與其相匹配的健康對照組[17]。術前、術后第1天和第2天分別測定外周血單個核細胞中循環EPCs的數量，其定義為CD34+/KDR+細胞。與基線值比較，手術導致循環EPCs水平在第1天和第2天顯著升高，對照組中EPCs水平無變化。手術組的變化幅度明顯大于對照組。接受非腫瘤性疾病腹腔鏡手術的受試者術后EPCs水平也有所增加。患者手術組和健康對照組的主要特征為：在年齡、性別分布、體重、血脂和血壓等方面比較，差異無統計學意義，而手術干預后癌癥患者的白細胞計數、血漿C反應蛋白水平明顯升高，總、高密度脂蛋白膽固醇、血清甘油三酯下降，EPCs計數的變化與年齡、體重、血脂參數、血壓或術后C反應蛋白水平比較差異無統計學意義，手術干預時間是唯一與EPCs計數變化有顯著直接關系的因素。本研究證明了腹腔鏡手術干預后，循環的CR34+/KDW細胞在腹部腫瘤患者中迅速增加。綜上所述，接受選擇性腹腔鏡手術的癌癥患者術后EPCs增加，而手術應激誘導的EPCs動員對腫瘤和腫瘤轉移生長的潛在不良影響需要在未來的研究中加以解決。

六、展 望

介入手術后，EPCs被動員通過血液循環向受損傷部位和缺血組織聚集從而發揮其生理作用，參與胚胎血管形成、出生后血管形成、血管創傷后血管愈合、缺血性疾病血管再生等。EPCs的數量反映了修復內皮和血管損傷的內源性能力。另外，EPCs的數量還與高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙、年齡等危險因素呈負相關，與心血管疾病發生率和病死率有關[18～21]。然而，EPCs的研究還未完全，有必要進一步研究EPCs的不同亞型，并評估其在人類疾病中的功能作用，使其在各類手術中的進一步研究成為可能，為外科醫生提供新的治療方式。