Micro RNA在缺血性卒中后炎癥反應中的研究進展

勵志英

天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸部，天津市 300000

Micro RNA(miRNA)是一類小型非編碼RNA，長度為18～25bp，與其靶mRNA結合后，能夠在轉錄水平直接調節基因表達，在許多細胞生物學和分子通路中起著核心調控作用。大量證據表明，miRNA參與增殖、造血、代謝、免疫功能和卒中后抑郁等多種疾病的生理和病理過程的調控[1]。近年來臨床及動物實驗均發現，卒中后miRNAs表達譜異常，miRNAs是促進缺血性卒中發生、發展的關鍵介質。目前，已有研究者提出將miRNAs列為卒中的新型生物標志物，用于卒中的診斷、治療、預后評價。最新研究表明，使用間充質干細胞衍生的外泌體來表達miRNAs，用于治療卒中等各種疾病，并取得了較好的效果[2]。

1 腦缺血后腦內的炎癥級聯反應

腦缺血/再灌注損傷引起腦內一系列復雜的病理生理學級聯反應，包括多種細胞生物學過程出現異常。在缺血階段，由于血液供應迅速減少導致細胞正常離子梯度破壞、細胞興奮性毒性和神經元死亡；而在再灌注階段，氧的恢復導致氧化應激損傷；血流的恢復導致炎癥和水腫，也進一步增加了缺血組織神經細胞變性、壞死的風險。

近年來，腦缺血后的炎癥反應逐漸受到重視。缺血后，腦內小膠質細胞首先被激活，釋放TNFα等致炎因子，并形成持續放大的炎癥級聯反應[3]。缺血還使血管內皮活化，表達趨化因子及黏附分子加重炎癥反應；并釋放MMP9等破壞血腦屏障[4]。在趨化因子等的作用下，循環中的白細胞(如中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞)等通過損傷的血腦屏障侵入腦實質，促使膠質細胞進一步活化并協同產生更多的炎癥因子，加重神經損害。如中性粒細胞、單核/巨噬細胞能生成活性氧和TNFα等致炎因子，促進小膠質細胞分泌致炎因子，使神經損傷加劇。中性粒細胞還表達MMPs破壞血腦屏障，進一步促進炎性細胞浸潤；中性粒細胞本身還發生粘附聚集，阻塞微血管，引起繼發血栓[5]。

從時間上來看，缺血后幾分鐘炎癥反應就已經啟動，缺血后3h內缺血區就可見中性粒細胞浸潤，并一直持續至再灌注后的24h。大量前炎癥介質，如化學因子和細胞因子等的爆發性表達也有著同樣的時間規律。對卒中動物的研究表明，抑制中性粒細胞引起的炎癥反應可減少腦缺血后神經變性，并改善神經功能。但同樣的抗炎治療在卒中患者上卻未得到類似的療效。

2 miRNAs表達水平在腦缺血后出現變化

多種miRNAs的表達水平在腦缺血后很快就出現顯著變化，甚至缺血后30min內就出現改變。大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠模型，其缺血皮層中的許多miRNAs(如miR-155、miR-297a、miR-466f、miR-466h和miR-1224)在MCAO后24h內顯著上調。Liu等[6]以MCAO大鼠為模型，于缺血后0～168h的不同時間點分析腦組織miRNAs表達譜。共發現346個差異表達的miRNAs，其中miR-21、miR-142-3p、miR-142-5p和miR-146a在缺血后48～168h較急性期(0～24h)顯著上調；而miR-196a/b/c、miR-224和miR-324-3p的表達趨勢則相反。此外，miR-206、miR-290、miR-291a-5p和miR-30c-1*從0～24h增加，隨后從48～168h逐漸減少，且表達量與梗死面積呈正相關。

3 miRNAs調節腦缺血后的炎癥反應

許多miRNAs被證實可調節腦缺血后的炎癥反應，其調節炎癥的主要機制是調控靶細胞中細胞因子的表達。

3.1 miRNAs對缺血后神經元的影響 Yu等[7]在糖氧剝奪的條件下培養皮質神經元，轉染腺病毒使其過表達miR-22，可降低神經元表達促炎因子TNF-α、IL-6、COX2和iNOS的水平，提高抗炎細胞因子IL-10的水平。此外，miR-22還可降低短暫局灶性腦缺血引起的炎癥、梗死灶體積、神經功能損傷。miR-22對炎癥的調節是通過降低NF-κB協同激活因子(NCOA1)的表達，進而顯著抑制NF-κB活性實現的。此外，miR-22通過抑制Caspase 3活性，增加抗凋亡基因bcl-2表達而降低凋亡基因bax表達，進而降低皮層神經元的凋亡。

抑制NF-κB表達已經被證實具有誘導腦缺血后神經保護的作用。其他miRNAs對炎癥的調控作用也與NF-κB通路關系密切，但受其調節的靶mRNA仍不清楚。缺血性腦損傷可誘導內質網應激及細胞內Ca2+平衡紊亂。葡萄糖調節蛋白78(Glucose-regulated protein 78, GRP78)是內質網應激的標志蛋白，也是NF-κB的激活因子，其在應激狀態下表達提高，以維護內質網正常功能及維持細胞內Ca2+平衡。miR-181a過表達可誘導GRP78表達增加，從而加劇缺血損傷。Xu等[8]以MCAO大鼠為模型，通過側腦室和靜脈給藥途徑觀察miR-181a拮抗劑的作用。發現miR-181a拮抗劑治療后，腦梗死面積明顯縮小，神經功能缺損改善；抑制miR-181a表達還可降低NF-κB活化和白細胞中樞浸潤，且治療效果至少能維持1個月。miR-181a拮抗劑的靶點包括bcl2和x連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)。

miRNAs是調控Toll樣受體信號通路的重要因子。骨髓分化因子88(MyD88)是Toll樣受體、IL-1受體等的關鍵下游配體，能介導NF-κB的核易位。miR-203過表達可通過降低MyD88水平，進而抑制下游NF-κB信號傳導；miR-203能抑制炎癥因子IL-8和TNFα的分泌，從而減弱缺血后的炎癥反應，減少糖氧剝奪導致的神經元死亡[9]。

具有系統性高炎癥因子水平的卒中患者，其神經功能恢復較差。對31例急性缺血性卒中患者的血清miRNAs分析結果顯示，卒中后miR-124和miR-9水平下降與較大的梗死體積、增加的炎癥因子水平呈負相關，這些炎癥因子包括基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和高靈敏度C反應蛋白(hs-CRP)[10]。MMP-9可致腦微血管內皮細胞間緊密連接和基底膜破壞，BBB 通透性增加。hs-CRP則與卒中及神經功能缺損嚴重程度相關。

提取急性缺血性卒中患者(n=50)血樣中的外顯子進行分析，發現患者外顯子中miR-223的表達較對照組明顯升高，并與NIHSS評分呈正相關。預后差的腦卒中患者外顯子miR-223水平高于預后好的患者。提示外顯子miR-223增多與急性缺血性卒中的發生、卒中的嚴重程度和短期預后有關[11]。

3.2 miRNAs對缺血后小膠質細胞的影響 體外研究進一步表明，miR-124過表達減少了實驗性變態反應性腦脊髓炎模型體內TNFα等炎癥因子的水平，并抑制了小膠質細胞的活化。小膠質細胞是腦內固有的免疫細胞，其對缺血損傷后的炎癥信號高度敏感。小膠質細胞激活后，會釋放ROS、前炎癥因子、細胞因子以及蛋白水解酶以介導腦損傷[3]。雖然小膠質細胞適度激活是神經可塑性和清除壞死神經元所必需，但其過度活化則導致腦缺血后的神經毒性和腦損傷。很多miRNAs可調節小膠質細胞的活化，并對缺血后腦組織產生保護作用。在永久性MCAO的嚙齒動物模型中，miR-424過表達可抑制小膠質細胞的活化，并減少梗死灶體積[12]。體外實驗中，miR-424通過在翻譯水平抑制細胞周期因子(如cyclin D1、細胞分裂周期25A和細胞分裂蛋白激酶6等)來抑制小膠質細胞激活[12]。糖氧剝奪誘導的小膠質細胞活化需要MyD88的介導，采用miR-203過表達來抑制MyD88，防止了糖氧剝奪后小膠質細胞的激活和神經元損傷；而腦內給予miR-203模擬劑，能下調MCAO大鼠腦內MyD88水平，并減輕了炎癥反應及繼發性腦損傷[9]。

除了調節NF-κB信號通路，miR-181a還參與調節小膠質細胞的活化。采用miR-181a拮抗劑治療，可減少缺血后小膠質細胞標志蛋白Iba1的水平，并減少MCAO后的神經變性損傷[8]。

3.3 miRNAs對缺血后星形膠質細胞的影響 有證據表明，miR-181影響腦缺血后炎癥反應的作用與星形膠質細胞有關。在培養的星形膠質細胞的體外炎癥模型中，抑制miR-181導致前炎癥因子水平增加(如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和高流動性組盒-1蛋白)，而miR-181過表達則增加了抗炎因子IL-10的水平[13]。

采用骨髓相關蛋白-8(MRP8)在體外誘導星形膠質細胞的炎癥反應，發現miR-132、miR-146a和miR-155水平變化；同時可見TLR4和下游炎癥因子水平明顯上調。miR-132通過調控靶向IL-1受體相關激酶4(IRAK4)水平，進而負反饋調節IL-1β和IL-6的水平，而不是傳統認為的TNF-α。該結果也提示miR-132在神經系統疾病中內源性配體誘導的固有免疫應答調節中的重要性[14]。

3.4 miRNAs對缺血后少突膠質細胞的影響 新生少突膠質細胞參與缺血性腦損傷的修復。采用成年MCAO模型大鼠，發現缺血側腦室胼胝體和室下區miR-146a的密度顯著增加。在體外，神經前體細胞(NPCS)過表達miR-146a，可促進其少突膠質細胞分化。在原代少突膠質細胞中過表達miR-146a則增加了髓鞘蛋白的表達，而內源性miR-146a的減少則抑制了髓鞘蛋白的生成。miR-146a也負調節少突膠質細胞中靶基因IRAK1的表達。IRAK1的減少能顯著增加髓鞘蛋白的生成，并減少少突膠質細胞的凋亡。提示miR-146a可能介導了卒中誘導的少突膠質細胞的生成[15]。

在體外，miR-17-92基因簇能促進少突膠質細胞形成、神經發生和軸突生長。Xin等[16]采用MCAO大鼠，靜脈注射富含miR-17-92基因簇的多能間充質干細胞外顯子，并以普通多能間充質干細胞外顯子做對照，于28d后觀察樹突、軸突、突觸和髓鞘重塑的變化，發現富含miR-17-92基因簇的外顯子治療能改善神經功能，并促進缺血半暗帶區域的少突膠質細胞形成、神經發生和神經樹突重塑。

總之，miRNAs參與了腦缺血后的神經炎癥反應的調控。由于miRNAs可以靶向細胞內多個調控網絡中的數百種蛋白質，并對各類神經細胞產生影響，因此通過特異性藥物和非藥物治療抑制參與多種致病機制的miRNAs表達，可能有利于腦卒中后的康復。