糖尿病腎病和miRNA相關性的研究進展

宋 鑫 劉云啟

濱州醫學院附屬醫院腎內科，山東省濱州市 256603

糖尿病是一種異常的代謝性疾病，糖尿病患者數量的持續增長以及其并發癥即DN的出現終將對個人及家庭經濟產生巨大的負擔，而目前尚無法提前預測DN的出現及有效治愈DN。當前臨床工作中，DN是根據患者臨床癥狀及尿的化驗進行常規診斷的，例如蛋白尿，范圍從微量白蛋白尿(30～300mg/d)到大量白蛋白尿(≥350mg/d)。然而，蛋白尿的發生也可以出現在其他腎臟疾病中，如膜性腎病，因此我們無法得知糖尿病患者出現了蛋白尿是并發了DN還是單純的糖尿病合并其他腎臟疾病，這也說明尿蛋白、eGFR等檢查在診斷DN方面的敏感性和特異性較差。因此發現能夠對DN進行早期診斷，盡早評估腎臟損傷程度的新型生物標志物對于減少人類慢性腎臟疾病的負擔是極其重要的。在DN的實驗模型中，發現miRNA與內皮細胞和心血管功能障礙相關。因此，miRNA符合用作診斷糖尿病及其血管并發癥的生物標志物的標準。

1 DN介紹

DN是糖尿病最常見、最嚴重的慢性微血管并發癥之一，主要是以腎小球基底膜增厚、系膜細胞增生、足細胞纖維化和凋亡為病理特征，隨著病情進展可出現腎小球結構和功能的異常。根據DN的病程及生理演變過程，可分為5期，早期主要表現是微量白蛋白尿，容易被忽視。通常于第4期出現明顯的臨床表現，如鈉水潴留導致肢體腫脹、大量蛋白尿及因血液中低氧導致的疲勞和惡心等癥狀。如不及時治療，就會進展至第5期——ESRD，此時腎臟功能衰竭，有效的治療方法為腎透析或腎移植[1]。隨著糖尿病患病率的增加，透析患者中一半以上為DN，它與心血管死亡事件的高風險性息息相關。

2 miRNA介紹

自從1993年miRNA首次被Lee等人發現以來，至今為止已發現2000多種人類miRNA[2]。miRNA屬于非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)的一種，其成熟形式為單鏈RNA分子，長度為18～25個堿基，其序列在動物物種中具有高度保守性。miRNA主要是通過降解信使RNA或抑制蛋白質翻譯來調控轉錄后基因表達，在細胞增殖、凋亡、遷移、分化和自噬等多種生物學過程中發揮重要作用[3]。研究表明，miRNA表達的失調與多種疾病的發生與發展有關，如糖尿病及其并發癥(糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變)、心血管疾病(心肌病、動脈粥樣硬化)、腎臟疾病(腎纖維化、多囊腎)以及大多數癌癥[4-5]。現就不同miRNA(miR-21、 miR-192、miR-451、miR-23b、miR-27、miR-R17)調節對DN的影響進行綜述。

3 miRNA與糖尿病腎病

3.1 miR-21 研究表明miR-21通過靶向作用于腎組織的PTEN(磷酸酶和張力蛋白同源基因)和smad7促進腎臟纖維化。另外發現過表達的miR-21可以下調smad7/p-smad7和上調smad3/p-smad3的表達來增強TGF-β1誘導的上皮間充質轉化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)，而通過抑制miR-21不僅能夠阻止EMT和腎纖維化的進展，還能改善DN的腎臟結構和功能[6]。Malte等人[7]研究發現，在DN中miR-21集中存在于腎小球細胞，通過靶向細胞分裂周期25a和細胞周期蛋白依賴性激酶-6能夠阻滯細胞周期并促進系膜細胞(Mesangial cell，MC)肥大，還能通過調節PTEN導致足細胞功能障礙。這意味著抑制miR-21的表達可作為一種有效的治療手段來緩解DN腎臟纖維化。然而，Jennifer等人[8]的研究結果顯示，在DNA損傷和Tgfb1-TG小鼠模型中，miR-21的缺失可以加速腎小球損傷和足細胞凋亡，表明miR-21的表達在腎小球損傷中具有保護作用。他們的研究結論存在分歧可能與研究標本不同、樣本量差異等因素有關，miR-21與DN之間的聯系還需要我們繼續進行探究。

Wang等人[9]研究報道，在DN小鼠模型中，血清miR-21表達與尿微量白蛋白與尿肌酐比值(ACR)呈正相關，與肌酐清除率(Ccr)呈負相關，miR-21抑制劑不僅可以降低血清miR-21和ACR，還可以升高Ccr。同時，血清中的miR-21與腎組織中的變化趨勢相一致，直接檢測血清miR-21可以替代檢測腎組織miR-21。結果表明血清miR-21的變化可以間接反映腎臟功能，可以作為診斷DN的生物標志物，同時抑制miR-21的表達也不失為一種治療DN的有效手段。

3.2 miR-192 高糖毒性下，腎臟缺乏自噬活性，使得腎臟細胞更易受到損傷。Supriya等人[10]研究發現，miR-192在DN的自噬過程中起著重要的調節作用。在DN小鼠模型中，miR-192的過表達可以抑制小鼠腎小球MC中的自噬，用LNA-anti-miR-192寡核苷酸抑制miR-192的表達或敲除miR-192可逆轉其對自噬的抑制以及減少腎小球MC肥大，這說明miR-192的過表達可以促進DN的發展。Liu等人[11]在DN大鼠模型中觀察到miR-192的表達與早期生長反應基因-1 (Egr-1)的表達呈現相關性，Egr-1可通過促進系膜細胞增殖、促進TGF-β1的表達、加速腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化等多種途徑參與腎臟纖維化。他們推測miR-192可能在DN進展中起到啟動子的作用，通過負調控Egr1的表達從而延緩腎小管間質纖維化(Tubular interstitial fibrosis，TIF)的進展。他們的發現表明miR-192在DN中具有腎臟保護作用。上述兩組人研究結果有所不同，這可能與miR-192在不同的動物模型及細胞系中的差異性表達有關。

Yang等人[12]研究表明隨著DN的進展，盡管miR-192在血清中的表達降低，但其在尿液中的表達卻是升高的。無論在血清還是尿液中，miR-192的AUC-ROC均高于ACR，并且ACR中的尿蛋白含量主要與腎小球硬化所致的濾過膜通透性增加有關，受人體內總蛋白、器官功能、機體狀況和情緒等多種因素的影響，而血清和尿液中的miR-192則較穩定，幾乎不被降解，這表明比起臨床上常用的檢測指標ACR，miR-192能更好地評價腎臟損傷程度。

3.3 miR-451 Ywhaz編碼的蛋白屬于14-3-3蛋白家族，是一組高度保守的蛋白，在細胞凋亡和細胞周期調控中起重要作用，它既是糖尿病相關基因，也是miR-451的靶基因。MAPK通路是公認的糖尿病相關信號傳導通路，它可以促進炎癥和纖維化反應，Ywhaz可刺激蘇氨酸/絲氨酸激酶raf1的活化，使MAPK磷酸化，引起細胞生長、分化、癌變[13-14]。miR-451可以通過mRNA 3’非翻譯區(3’UTR)負調控Ywhaz的表達，進而影響Ywhaz/MAPK信號傳導通路，下調MAPK信號通路關鍵蛋白p-p38 MAPK和p-MKK3表達，從而抑制高糖誘導的系膜細胞增殖[15]。因此，miR-451可能在DN的發病中起保護作用。大型多功能蛋白酶7(LMP7)是一種免疫蛋白酶體亞單位，可以激活核因子-κB(NF-κB)，而NF-κB的活化在DN的進展中起重要作用。Sun等人[16]發現miR-451過表達可以直接抑制LMP7的表達從而抑制NF-κB的活化，進而影響其與DN相關的促炎癥因子(如TNF-α、IL-18、MYD88、ICAM-1等)啟動子結合，從而下調系膜細胞中促炎癥因子的轉錄。進一步研究發現在miR-451調控NF-κB活化的過程中，LMP7是一個不可缺少的中間作用因子，當LMP7活性被抑制的時候，調節miR-451的表達并不能影響NF-κB的活化。這些結果表明miR-451可以通過調控LMP7/NF-κB通路在DN進展中發揮作用[17]。

3.4 miR-23b Zhao等人[18]在DN小鼠中發現P53是miR-23b啟動子的結合位點，通過抑制P53或上游的p38 MAPK可增強miR-23b的表達。GTP酶活化蛋白2(Ras GTPase-activating protein-binding protein 2，G3BP2)是miR-23b的作用靶點，通過抑制G3BP2的表達可觀察到miR-23b表達的增強以及P53和P38 MAPK表達的減少。他們推測高血糖可能是通過miR-23b/G3BP2反饋回路來抑制P53和P38 MAPK的表達，進而參與DN的發病，而miR-23b發揮作用的主要機制是通過作用于P38 MAPK來減少細胞外基質蛋白堆積所致的系膜擴張。這些發現揭示了miR-23b在DN中的保護作用。有相關報道，TGF-β1誘導的EMT過程在DN腎臟纖維化的發生和發展中起主導作用，而高遷移率族蛋白A2(High mobility group A2，HMGA2)則通過多種機制參與TGF-β1介導的EMT[19]。另外，研究[20]發現高糖環境下的腎臟EMT與miR-23b的表達降低相關，而miR-23b高表達可以通過抑制HMGA2的表達來抑制PI3K/AKT信號通路的激活，進而減弱糖尿病腎臟EMT，改善腎臟形態、腎臟纖維化和腎功能，并防止高血糖環境下DN的發生和發展。這些發現提供了miR-23b作為EMT抑制劑的證據，增加miR-23b的表達可能有助于DN的治療。

3.5 miR-25 Li等人[21]發現在高糖環境下培養的人近端腎小管上皮HK-2細胞中miR-25呈時間依賴性下降。miR-25過表達能減少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產生并抑制高糖誘導的細胞凋亡以此來保護HK-2細胞，它的抗凋亡作用依賴于PTEN/AKT通路的激活。PTEN既是一個經典的促凋亡基因，同時也是miR-25的一個直接和功能性靶標，在DN患者的腎活檢組織樣本中可看到PTEN表達上調。過表達的PTEN可以消除miR-25對ROS產生和細胞凋亡的抑制作用，這說明PTEN的過表達可以逆轉miR-25對腎小管上皮細胞損傷的保護作用。他們的發現提示過表達miR-25可能有助于DN的治療。Liu等人[22]發現在DN小鼠中，miR-25過表達可通過抑制足細胞功能障礙和氧化應激來減少蛋白尿和減弱腎小球纖維化，同時還能抑制RAS系統來降低腎性高血壓，并且這種對RAS系統的抑制作用并不是通過影響氧化應激產生的。而在正常小鼠中抑制miR-25表達則會導致腎臟纖維化增加、足細胞塌陷、蛋白尿和高血壓，miR-25的過表達可逆轉這些不良表現。因此，從DN的治療角度來看，增強miR-25的表達是有利的。

3.6 miR-217 Sun等人[23]研究發現，在高糖環境下培養的足細胞中miR-217表達增加，通過抑制miR-217的表達可減弱高糖對細胞活性的抑制作用，還能抑制細胞凋亡和ROS產生。在進一步的研究中他們還發現PTEN在足細胞中是miR-217的作用靶點，可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活來增強自噬，進而保護足細胞，而通過抑制miR-217的表達可增強PTEN介導的自噬，以此來改善高糖環境下的足細胞損傷和胰島素抵抗。上述研究發現表明通過抑制miR-217的表達可以對DN的發展起到阻礙作用，是一個潛在的DN治療靶點。

4 小結與展望

DN的進展是一個長期過程，隨著病情的加重終會發展至尿毒癥，最終離不開透析治療。近年來，隨著人們對miRNA認識的不斷加深，發現其在多種疾病包括DN中扮演著重要角色。由于miRNA在血液和尿液中都比較穩定，因此通過檢測miRNA水平來診斷早期DN有較好的效果。同時，miRNA在DN發病中的作用機理也逐漸被我們所了解，它可以通過調控多種信號通路來影響DN的進程，并且通過增強或抑制不同的miRNA的表達可以對DN的進展起到阻礙作用。雖然目前對miRNA和DN關系的研究越來越深入，包括大量的體外細胞實驗及動物體內實驗，但miRNA在DN臨床方面應用的研究仍處于初級階段，需要我們繼續去探索。