輔酶Q10生物合成代謝調(diào)控策略研究進(jìn)展

杜家文，黃建忠，江賢章

（福建師范大學(xué)工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350117）

輔酶Qn（CoQn），也叫泛醌（Ubiquinone），是一類脂溶性醌類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化能力；由一個(gè)醌環(huán)與不同數(shù)目的異戊烯側(cè)鏈組成，其苯醌結(jié)構(gòu)可以可逆地還原為對(duì)苯二酚化合物，是呼吸鏈中的氫傳遞體。側(cè)鏈異戊烯的個(gè)數(shù)（n）決定了輔酶Qn的種類。人體中，輔酶Q10是參與線粒體內(nèi)膜呼吸鏈電子傳遞的重要組分，在降低自由基傷害、改善心肌細(xì)胞、預(yù)防心血管疾病中起到重要作用[1]。本文根據(jù)近年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物輔酶Q10代謝調(diào)控策略進(jìn)行綜合論述。

1 誘變篩選

化學(xué)誘變是微生物育種的重要手段，將輔酶Q10的生產(chǎn)菌株進(jìn)行化學(xué)誘變后，在加有輔酶Q10合成途徑抑制劑或呼吸鏈電子傳遞抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，可以選育出輔酶Q10的高產(chǎn)菌株。例如，將根癌土壤桿菌（A.tumefaciens）化學(xué)誘變后，分別涂布至加有道諾霉素和甲萘醌（輔酶Q10結(jié)構(gòu)類似物）、L-乙硫氨酸（甲硫氨酸前體類似物）、芳香族氨基酸合成以及電子傳遞鏈抑制劑的平板上，成功獲得了高產(chǎn)Q10的根癌土壤桿菌[2]。另外，在可以產(chǎn)生胡蘿卜素的輔酶Q10生產(chǎn)菌株中，有研究發(fā)現(xiàn)胡蘿卜素產(chǎn)量的降低可以導(dǎo)致輔酶Q10產(chǎn)量的升高。其原因可能是胡蘿卜素降低后，細(xì)胞內(nèi)需要合成更多的輔酶Q10來增加細(xì)胞的抗氧化能力，免受自由基的傷害；也可能是胡蘿卜素降低使得兩者共同的中間體異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）被更多地用于合成輔酶Q10。

2 增加輔酶Q10的前體

2.1 增加異戊烯前體

增加異戊烯前體是提高輔酶Q10的有效手段。大腸桿菌中通過強(qiáng)化表達(dá)2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）合成途徑上的關(guān)鍵限速酶[2]基因可以有效提高其輔酶Q10的生產(chǎn)水平。MEP途徑的第一步是由1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（DXP合成酶）催化3-磷酸甘油醛（G3P）和丙酮酸縮合生成DXP的反應(yīng)。有研究報(bào)道在可以合成胡蘿卜素、番茄紅素的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中，增加DXP合成酶基因的表達(dá)水平，可有有效提高胡蘿卜素、番茄紅素的產(chǎn)量[3]。使用同樣的策略在可以合成輔酶Q10的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中，過表達(dá)來源于假單胞菌綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的DXP合成酶基因，使輔酶Q10的產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了1.8倍[4]。

2.2 增加芳香環(huán)前體

在細(xì)胞中提高芳香環(huán)前體的供應(yīng)是提高輔酶Q10產(chǎn)量的另一有效方法。由分支酸途徑合成的對(duì)羥基苯甲酸（pHBA）是輔酶Q10的母核，分支酸裂合酶（UbiC）是將分支酸轉(zhuǎn)化為pHBA的酶。除了轉(zhuǎn)化為pHBA，分支酸還是細(xì)胞體內(nèi)合成苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、葉酸、維生素K2等化合物的前體物質(zhì)。因此細(xì)胞內(nèi)UbiC酶的含量決定了分支酸代謝的走向。產(chǎn)輔酶Q10的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中，在過表達(dá)多聚異戊烯轉(zhuǎn)移酶（UbiA）的同時(shí)，增加UbiC的表達(dá)量可以有效增加輔酶Q10的產(chǎn)量[5]。在鎖擲酵母（S.johnsonii）的研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加pHBA即可使其輔酶Q10產(chǎn)量提高8倍[6]。然而，體外添加pHBA對(duì)大腸桿菌輔酶Q10的產(chǎn)量卻幾乎沒有影響[7]。以上研究表明，在異戊烯前體供應(yīng)充足的前提下，通過提高UbiA的表達(dá)水平，或者提高細(xì)胞對(duì)pHBA的攝取量可以使分支酸的代謝流向輔酶Q10合成方向，從而增加輔酶Q10的產(chǎn)量。

2.3 過表達(dá)泛醌修飾途徑基因

在可產(chǎn)生輔酶Q10的重組大腸桿菌中，由泛醌修飾途徑上的基因UbiA催化的多聚異戊烯側(cè)鏈與pHBA之間的縮合反應(yīng)是合成輔酶Q10的關(guān)鍵限速步驟[2]。與僅僅過表達(dá)十聚異戊烯焦磷酸合成酶（DPS）的大腸菌株相比，共同過表達(dá)UbiA與DPS的菌株中，輔酶Q10產(chǎn)量提高了3.4倍[5]。然而，在大腸桿菌中過表達(dá)其他泛醌修飾途徑上的基因UbiB、UbiG及單加氧酶(UbiH)，對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量并沒有顯著影響[5]，這可能是pHBA或異戊烯前體供應(yīng)不足所致。

3 調(diào)控中心代謝提高輔酶Q10產(chǎn)量

與輔酶Q10一樣，番茄紅素合成的前提物質(zhì)也是異戊二烯。有研究發(fā)現(xiàn)，通過中心代謝調(diào)控，使碳代謝流轉(zhuǎn)向番茄紅素合成途徑，可以在重組大腸桿菌中顯著提高番茄紅素的產(chǎn)量[7]，同樣的策略也可應(yīng)用于增加輔酶Q10的合成。另一種策略是通過平衡中心代謝的還原力來增加輔酶Q10的合成量。例如，研究表明在根瘤菌R.radiobacter中，NADH/NAD+比例的升高是其高產(chǎn)輔酶Q10的重要原因[8]，基于這一發(fā)現(xiàn)，通過過表達(dá)NAD+依賴的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GapA），使NADH/NAD+的比例提高25%，可以成功將輔酶Q10的產(chǎn)量提高2倍[8]。

4 優(yōu)化培養(yǎng)條件提高輔酶Q10產(chǎn)量

許多研究表明，發(fā)酵過程中降低培養(yǎng)基中的溶氧濃度，可以提高R.radiobacter和R.sphaeroides的輔酶Q10產(chǎn)量[9]，例如將溶氧由20%降到5%，R.radiobater的輔酶Q10產(chǎn)量提高了4倍[10]。為了研究這一現(xiàn)象背后的機(jī)制，人們利用細(xì)胞色素c氧化酶的抑制劑疊氮化合物和解偶聯(lián)氧化磷酸化試劑（2,4-二硝基酚，DNP）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中疊氮鈉濃度的升高，輔酶Q10濃度也隨著升高。然而，DNP對(duì)輔酶Q10的積累并沒有效果，這一結(jié)果表明降低氧供應(yīng)引起的Q10產(chǎn)量提高的原因并不是由于細(xì)胞質(zhì)子梯度變化，而是限氧本身引起。

5 展望

迄今為止，通過誘變和選擇抑制劑分離菌株已被證實(shí)是提高輔酶Q10產(chǎn)量的最成功策略。但是，由于選擇抑制劑培養(yǎng)基上篩選的菌株與輔酶Q10產(chǎn)量之間沒有直接的關(guān)系，運(yùn)用這種方法很難再進(jìn)一步提高輔酶Q10產(chǎn)量。通過對(duì)自然界中高產(chǎn)輔酶Q10的菌株進(jìn)行對(duì)比分析，可能會(huì)得到有價(jià)值的線索，并應(yīng)用于基因工程菌株的改造。