糖尿病腎病動物模型研究進展*

田 雄 鄭敬民

(浙江省臺州醫院，臺州 317000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的慢性并發癥之一，也是導致終末期腎病的主要原因。DN臨床早期表現為腎小球濾過率減少，后期出現蛋白尿增多、動脈血壓升高和體液潴留，最終導致腎衰竭，并出現尿毒癥等癥狀，嚴重危害人類健康。控制血糖及血壓能夠減緩糖尿病患者向終末期腎病轉化，但目前臨床上尚缺乏新的治療方法醫治糖尿病腎病[1-2]，其最根本的原因是對糖尿病腎病的發病機制尚未完全闡明。建立適當的動物模型，可以為研究DN的病因、發病機制和病理生理改變提供重要的線索，同時也為臨床治療DN提供理論依據[3]。糖尿病并發癥聯盟及動物模型腎病小組委員會(AMDCC)基于人類DN的臨床和病理特征，概括了以下關于DN的嚙齒動物模型的驗證標準：(1)腎臟功能退化50%；(2)蛋白尿增加10倍以上；(3)病理特征包括血管基質擴張(+/結節)，腎小球基底膜增厚，小動脈透明質和管狀纖維化[4]。一個理想的糖尿病腎病模型應該符合所有這些標準。然而，目前的各類動物模型并未完全滿足以上標準，無法理想地復制出人類DN，這也解釋了諸多在臨床前期試驗中有益的療法，在臨床應用中被證明無效的原因[5]。因此，尋找并構建能真實模擬人類DN主要特征的動物模型，仍然是未來有意義的研究方向。本文將現有DN模型加以綜述，比較其優缺點，以期未來能復制出理想的DN動物模型，為DN的防治和研究提供有效的途徑。

1 誘發性DN動物模型

誘發性模型相比于自發性動物及轉基因動物模型，成本低廉，操作方便，應用比較廣泛常見的有化學藥物誘導、高糖高脂飲食誘導以及化學藥物和高脂飲食聯合誘導、化學藥物聯合手術等手段[6]。

1.1 化學藥物誘導DN模型

最早的化學藥物誘導的 DN 模型是由Naccarator等[7]在1964年使用四氧嘧啶誘導建立。目前該類模型最常見的是由鏈脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶(ATX)作為主要藥物誘導而成。STZ和ATX對胰島細胞有很強的選擇性殺傷作用,其中 STZ通過影響葡萄糖激酶的功能，誘導DNA雙鏈的斷裂，高特異性殺傷胰島β細胞，使細胞內胰島素合成受損，導致胰島素分泌缺乏。STZ應用較為廣泛，適用于多種大小鼠模型且DN模型制備時間短，但此類模型腎臟病變比較溫和，而且STZ本身的非特異性毒性會干擾實驗結果判斷[8]。

造模方法：最常用的使用SD及Wistar大鼠，小鼠作為造模對象也有相關報道。STZ腹腔注射劑量為50～75 mg/kg體質量，病程為4～24周。動物從4周開始出現腎臟早期病變，系膜基質擴張，基底膜增厚。隨病程延長，后期可出現腎間質小血管玻璃樣變等腎小管及間質病理改變，模型鼠尿蛋白排泄率增加[9]。

1.2 合并性誘導DN模型

為加快腎臟病理變化，縮短實驗周期，不同研究者對原有單一藥物誘導的DN模型加以改進，結合單側或部分腎切除、高糖高脂誘導等手段，加速糖尿病腎病進展。

Melissa等[10]在DN相對耐受的C57Bl/6 (B6)小鼠中，利用STZ結合單側腎切除術，成功地建立了Ⅰ型糖尿病腎病模型。研究人員對6周齡C57BL6/J 小鼠行左側腎切除術后，每只小鼠隔日注射50 mg/kg STZ，共3次。12周后，與對照組相比，模型組小鼠血糖水平差異顯著，24 h蛋白尿明顯增加；模型組小鼠腎小球肥大且損傷嚴重，腎小球系膜基質擴張， TGF-β1、cTGF、Collagen IV等纖維化標志物的表達水平明顯升高。

2 自發性動物模型

自發性動物模型是沒有經過任何人為干預，在自然情況下由于基因突變或染色體畸變等發生的DN模型。相比于誘導模型，自發性模型在一定程度上減少了人為因素，其發病原理及特征更切近人類DN。但此類模型種類有限，疾病動物飼養條件要求高，發病率低，病程長，價格較高[11]。

2.1 NOD (non-obese diabetic mouse)小鼠

NOD小鼠來源于ICR小鼠，它通過自身免疫系統破壞胰島細胞，小鼠胰腺在4～5周自發出現不同程度的炎癥反應，到24～30周齡時多數胰腺β細胞遭到破壞出現糖尿病，37周齡時NOD小鼠可發展為DN，主要表現為蛋白尿增加、腎臟病理學變化、系膜細胞增生、腎小球毛細血管基底膜增厚、細胞外基質增多、最后出現腎小球硬化[12]。

2.2 胰島素-2 Akita小鼠

此小鼠在Ins2(C96Y)中有一個突變，導致胰島素2 A、B鏈間無法正確地形成二硫鍵，導致胰島素構象發生劇烈的變化，同時對胰腺β細胞產生蛋白毒性，導致β細胞團減少，分泌胰島素的能力減弱。4周齡Akita小鼠就出現明顯的高血糖癥、高水平的白蛋白尿以及持續的組織學變化。另外，Akita小鼠還會出現高血壓及心臟衰竭等糖尿病并發癥[13]。

2.3 KK-Ay 小鼠

這種小鼠最早由日本學者近藤恭司和西村正彥將Ay基因導入KK小鼠體內建立。與KK小鼠相比，KK-Ay 小鼠早期會出現重度肥胖及高血糖，且模型小鼠腎臟損傷與人類2型糖尿病腎臟損傷非常相似，可作為2型糖尿病模型動物。因KK-Ay 小鼠體毛呈黃色，也有人稱其為yellow KK[14]。Ito等[15]報道了 KK-Ay小鼠腎小球的病理變化與人類DN早期階段的病理變化一致。該研究發現，KK-Ay小鼠的尿蛋白/肌酐比率明顯高于非糖尿病的BALB/c小鼠，其HbA1c的含量也明顯高于BALB/c小鼠(p<0.001)。AS和酸-甲胺銀染色結果表明，20周齡KK-Ay小鼠的腎小球中發生節段性硬化，而且AGEs和TGF-β定位在腎小球系膜區。

2.4 BB大鼠

此種大鼠是由Wistar大鼠經篩選而得，可作為自身免疫性胰島素依賴性糖尿病動物模型，其腎臟病理改變較輕微且周期較長，18個月才出現腎小球基底膜增厚，系膜容量增加。而尿蛋白及白蛋白排泄沒有出現明顯的改變，GFR卻明顯增加[16]。

3 基因工程小鼠模型

基因工程小鼠遺傳背景清晰，造模時間短。利用基因工程技術，可以便利地在動物基因組特定位點引入突變基因或將某一基因敲除，以此研究特定基因在動物發生與發育過程中的作用。但由于人類DN的發病機制和遺傳決定因素的闡述尚不完善，將相關的基因或遺傳變異納入模型，不能完全真實地反映人類DN。

3.1 eNOS 敲除鼠

在db/db小鼠中，eNOS基因敲除會導致高血壓和內皮功能障礙，并加速腎臟的損傷，可表現為早發性蛋白尿、小動脈透明質化以及腎小球濾過率下降50%。26周后其病理改變表現為腎小球系膜基質擴張、伴小動脈瘤的腎小球系膜溶解及kimmelstiel-wilson 結節性改變[17-18]。

3.2 OVE26小鼠

在FVB背景下，OVE26小鼠2月齡時出現蛋白尿，9月齡時表現出腎小球結節性硬化，并且蛋白尿增加了十倍。OVE26小鼠單側腎切除會促使多種DN特征包括蛋白尿、炎細胞浸潤、纖維化和基因表達的變化的產生[19]。

3.3 轉基因mRen-2大鼠

Kelly等[20]將小鼠Ren2基因轉入SD大鼠基因組，并觀察血管緊張素在糖尿病腎病發生發展中的作用。研究人員利用 STZ 誘導TG(mRen-2)27 大鼠成糖尿病后，其生物活性腎素大量增加，導致腎臟血流動力學發生改變，進而損傷腎臟；同時 TGF-β1表達增加，加重腎纖維化。

Betz和Conway[21]利用低劑量吲哚-3-甲醇處理mRen-2大鼠誘發中度高血壓。在沒有高血壓的情況下，STZ誘導的糖尿病大鼠蛋白尿增加了14倍，但只出現輕微的組織學和基因表達變化。在高血壓刺激下，高血糖導致糖尿病大鼠白蛋白尿增加了500倍，腎小球硬化和腎小管間質纖維化程度加重。

4 加重DN模型

化學藥物誘導和基因工程手段并不能完全概括人類的DN特征。將糖尿病易感模型與其他致病基因相結合，能夠加重模型鼠病理學病變及腎臟損傷程度[22-25]。

4.1 BTBR ob/ob小鼠

Hudkins等[26]對BTBR背景小鼠進行了ob/ob 瘦素突變，這些小鼠8周時出現明顯的高血糖癥狀，蛋白尿升高，腎小球系膜基質積累，20周時腎小球出現與晚期DN相似的病變。22周時，基底膜厚度增加約20%，系膜基質增加約50%。彌漫性系膜硬化(局部趨近結節性腎小球硬化)，局灶性小動脈玻璃樣變性，血管溶解，局灶性輕度間質纖維化。

4.2 MKR小鼠

Mallipattu等[27]構建的小鼠骨骼肌中的胰島素樣生長因子受體(IGF-1R)功能缺失鼠，即為MKR小鼠。這些小鼠體型偏瘦，存在明顯的胰島素抵抗、高胰島素血癥、高血糖和血脂異常，因此可作為非肥胖人類Ⅱ型糖尿病動物模型。糖尿病MKR小鼠表現出明顯的蛋白尿和腎小球損傷。24周的高脂飼料喂養會顯著增加MKR小鼠蛋白尿以及病理學改變包括腎小管擴張、顯著的足細胞減少和GBM增厚。

4.3 OVE26-TTRhRen雙轉基因小鼠

Thibodeau等[28]將STZ注射到TTRhRen轉基因小鼠中，發現其蛋白尿顯著增加和腎臟病理學明顯改變，而且其腎臟病變速度快于OVE26轉基因鼠。OVE26-TTRhRen 雙轉基因小鼠的白蛋白尿增加了40倍，并伴有更嚴重的組織病理學損傷，包括腎小球硬化和間質纖維化。在這些小鼠中，GFR在12～20周劇下降。

5 討論

隨著對DN動物模型研究的不斷深入，一些較為理想的動物模型也已建立，并在糖尿病腎病的分子機制研究中發揮了重要作用。但是，由于人類DN發病的復雜性以及實驗動物與人類DN的差異性，現有的動物模型無法完全滿足AMDCC腎病小組委員會關于理想DN模型的標準和完全重現人類DN疾病[29]。目前，化學誘導動物模型只能簡單地模擬早期人類腎病模型；自發性動物模型雖然可以較形象地模擬人類DN, 但其培養困難，造價高昂；基因工程小鼠遺傳背景清晰，造模時間短、成模效果較好，但大多數基因工程小鼠與人類DN仍然存在一定的差距；而將致病基因與易感模型鼠結合可以快速地建立糖尿病腎病模型，其中一些模型表現出人類DN的基本特征包括高水平的白蛋白尿、結節性腎小球硬化和高血壓，這可能是未來糖尿病腎病動物模型的發展方向。

新的DN動物模型制備不僅需要描述實驗動物腎臟功能和病理變化，還應該探究其相關因子轉錄水平的變化是否與人類疾病相關。模型動物能真實地模擬和反映人類DN相似的腎臟病理生理學變化，是人類糖尿病腎病研究的重要基礎。此外，將系統生物學、基因組學及代謝組學研究方法結合起來，不斷完善模型制備技術并增強DN復雜病因的轉化研究，有助于模擬出更接近人類DN的動物模型。因此，未來結合不同技術手段，從發病機制著手構建與人類DN發病病因、病程及病理相似的動物模型，依舊是今后糖尿病腎病領域的研究重點。