PNPLA3基因多態性與酒精性肝病發生的關系

李平生 崔恒官

酒精性肝病是臨床常見肝臟疾病，患者初期表現以脂肪肝為主，隨著疾病進展可發展為酒精性肝炎、肝硬化等[1]。本病病因除長期大量飲酒外，患者營養狀況及遺傳因素也會誘發酒精性肝病[2]。馬鈴糖蛋白樣磷脂酶蛋白3(patatin-like phospholipase domain containing 3，PNPLA3)是3T3-L1細胞向成熟脂肪細胞分化過程中合成的一種非分泌型脂肪因子。臨床研究顯示，PNPLA3基因與患者肝臟脂肪水平有關，還與肝炎、肝纖維化等病理改變密切相關[3]。本研究探討PNPLA3基因多態性與酒精性肝病的關系。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年1月至2019年1月在上海市青浦區朱家角人民醫院治療的酒精性肝病患者200例作為觀察組，納入標準：(1)診斷符合《酒精性肝病診療指南》中的標準；(2)漢族；(3)患者及家屬知情同意。排除標準：(1)藥物性肝病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎等；(2)合并有冠心病、惡性腫瘤、糖尿病等其他嚴重疾病。同時選取健康飲酒者218例作為對照組，觀察組和對照組一般資料比較見表1。

表1 觀察組和對照組一般資料比較

二、實驗方法

于清晨抽取兩組人員空腹靜脈血各5 mL，高鹽法進行外周血總DNA提取操作，隨后選用科那美(上海)科學儀器有限公司BD-200型超微量分光光度計對兩組DNA樣本濃度、純度進行檢測，并通過瓊脂糖凝膠實驗確定DNA完整性。采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性檢測兩組PNPLA3基因rs738409位點多態性：PCR擴增體系設置為：模板1.0 μL，10 mM dNTP 1.0 μL，Taq Buffer 5.0 μL，Taq酶0.5 μL，上下游引物[生工生物工程(上海)股份有限公司提供]各1 μL，去離子水35 μL；PCR反應條件參照如下：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；57 ℃，60 s；72 ℃，60 s，共35個循環。將反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并選用紫外燈進行鑒定。隨后選用貝克曼Biomek NX二代測序儀對PCR純化產物進行測序，并分析樣本基因表型。同時選用南京普朗醫用設備有限公司PUZS-300全自動生化分析儀檢測各基因型患者ALT、AST、GGT、ALP等肝功能指標，并選用深圳市一體醫療科技有限公司Hepatest超聲肝硬化檢測儀對患者肝臟硬度值進行測定。

三、統計學處理

統計分析采用SPSS 19.0軟件，ALT、AST等資料采用平均數±標準差表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；基因型比例等資料比較使用χ2檢驗；群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡法檢驗。檢驗水準α=0.05。

結 果

一、PNLA3基因rs738409位點多態性

經酶切電泳后，rs738409位點基因型有三種，分別為CC、GC和GG型。經Hardy-Weinberg檢驗，觀察組和對照組符合Hardy-Weinberg平衡定律。

二、觀察組和對照組PNLA3基因rs738409位點多態性分布

觀察組和對照組PNLA3基因rs738409基因型和等位基因比例差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組GG基因型和等位基因G比例分別為16.00%和37.50%。見表2。

三、觀察組不同基因型患者肝功能比較

觀察組PNPLA3基因rs738409位點CC型、CG型和GG型患者血清ALT、AST、GGT和ALP比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

四、觀察組不同基因型患者肝臟硬度值比較

觀察組PNPLA3基因rs738409位點GG型患者肝臟硬度值為(3.16±0.22)kPa，明顯高于CC型和CG型患者的(2.91±0.24)和(2.95±0.20)kPa，差異均有統計學意義(t=-8.292和-9.102，P<0.05)。

表2 觀察組和對照組PNLA3基因rs738409位點多態性分布

表3 觀察組不同基因型患者肝功能比較

討 論

PNLA3屬于patatin樣磷脂酶家族，體外實驗顯示，PNLA3具有部分酰基甘油及三酰甘油水解酶活性，但其體內生物活性臨床尚無確切結論[4-5]。PNLA3基因的148個位點變異可誘使其酶活性中心掩蓋，導致PNLA3失去酶活性，并導致以下病理生理改變：(1)促使肝內細胞脂質沉積，PNLA3 rs738409基因突變將影響apo-B脂蛋白分泌，并可降低極低密度脂蛋白表達水平，最終導致肝細胞內脂質沉積。(2)影響血脂水平，PNLA3 rs738409G等位基因突變可導致肥胖人群甘油三脂水平下降[6]；(3)影響脂肪細胞大小，相較CC型PNLA3基因，GG型PNLA3基因患者脂肪細胞更小[7]；(4)影響肝臟酶學，多項研究顯示，PNLA3基因rs738409基因型可導致人ALT、AST、GGT和ALP異常表達，并且其對患者肝臟損傷從兒童時期即開始。本組研究中，觀察組和對照組PNLA3基因rs738409基因型和等位基因比例差異有統計學意義，且觀察組GG基因型和等位基因G比例分別為16.00%和37.50%，表明PNLA3基因rs738409突變與酒精性肝病密切相關。

PNLA3基因rs738409突變導致的肝脂肪存儲及變性極易導致酒精性肝病，其機制可能與PNLA3基因rs738409G等位突變導致甘油三酯活性水解活性抑制，大量甘油三酯堆積于肝細胞內有關[8-9]。有研究表明[10]，PNLA3基因rs738409G等位基因突變與肝病患者肝損傷程度相關，患者ALT、AST、GGT和ALP水平要比未突變人群高出很多。但本組研究中，觀察組PNPLA3基因rs738409位點CC型、CG型和GG型患者ALT、AST、GGT和ALP比較差異無統計學意義，此結果與前面研究相悖，分析可能與本組研究樣本容量較少有關。肝臟硬度值是肝硬化常用評估指標，可有效提示肝纖維化及肝硬化程度。本組研究中，觀察組PNPLA3基因rs738409位點GG型患者肝臟硬度值為(3.16±0.22)kPa，明顯高于CC型和CG型患者，表明PNPLA3基因rs738409位點G等位基因突變與肝硬化密切相關。有研究表明，PNLA3基因rs738409G等位基因突變與肝病患者易感性、嚴重性以及纖維化程度相關。

本研究通過分組實驗發現，PNLA3基因rs738409G等位基因突變與酒精性肝病發生有關，并且與患者肝臟纖維化密切相關。但酒精性肝病是遺傳、個人行為習慣等多因素作用的慢性疾病，其發病機制復雜，涉及營養失衡、炎癥介質、基因多態性以及表觀遺傳學等。本研究僅對PNPLA3基因多態性在酒精性肝病中的價值進行初步分析，但對于PNPLA3基因多態性作用酒精性肝病的具體機制，目前尚無科學的解釋，還有待深入研究。