冠心病患者PCSK9基因V312F位點多態性與斑塊性質、脂代謝及細胞因子的相關性

劉春燕,劉小燕,李平,陳國才,耿召華

冠心病是臨床上最常見的心血管疾病之一，近年來隨著高脂血癥、高血壓、糖尿病、肥胖癥等代謝性疾病的增多，冠心病的發生率也呈逐年升高的趨勢，并對患者的生活質量、生命安全均造成威脅[1]。在冠心病的病情發展變化過程中，冠狀動脈斑塊的形成及性質的改變與脂代謝紊亂、炎性反應異常激活等環節密切相關，但具體的調控機制仍未十分明確。人枯草溶菌素轉化酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是由肝細胞表達并分泌的一類前蛋白轉化酶，能夠降解低密度脂蛋白膽固醇受體(LDLR)，影響LDLR所介導的LDL-C代謝并使LDL-C在體內蓄積，蓄積的LDL-C在冠狀動脈內膜沉積、逐步形成粥樣斑塊[2-3]。PCSK9基因在多位點存在多態性，多態性的產生會使編碼產物降解LDLR的活性發生改變，進而影響LDL-C的代謝并參與動脈粥樣硬化的進程。 筆者分析了冠心病患者PCSK9基因V312F位點多態性與斑塊性質、脂代謝及細胞因子的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月—2018年6月陸軍軍醫大學附屬新橋醫院心內科診斷冠心病患者120例作為冠心病組，男69例，女51例，年齡42～62(51.39±7.65)歲；合并高血壓46例，糖尿病37例，高脂血癥61例；有冠心病家族史23例。另納入同期于醫院體檢的健康者100例作為健康對照組，男58例，女41例，年齡39～60(49.93±7.12)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)入組標準：①均有發作性胸痛癥狀、經冠狀動脈CTA確診為冠心??；②首次診斷為冠心病。(2)排除標準：①合并先天性心臟病、冠狀動脈血管畸形；②既往有腦梗死、心肌梗死病史的患者；③合并自身免疫性疾病的患者；④正在服用他汀類藥物的患者。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 基因多態性檢測： 2組受試者均于晨起空腹時采集肘靜脈血2 ml并以EDTA抗凝，按照北京天根公司的血液基因組DNA提取試劑盒進行操作，設計PCSK9基因V312F位點的引物(上游5’-AAAGGGGAGCAGGTCTCCC-3’、下游5’-GCCCGCCCTCCCTCCGCCCTCCG-3’)，配置PCR反應體系50 μl后,按照95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s的程序反應35個循環，收集PCR產物后用ABI(型號：3100Avant)全自動DNA測序儀測定基因序列，根據測序結果判斷V312F位點的多態性。

1.3.2 冠狀動脈斑塊測定： 采用64排雙源CT儀進行冠脈CTA檢查，掃描范圍為主動脈弓肺動脈節段起始至膈肌下1 cm為止；將感興趣區設置在升主動脈，當CT值達到100 HU時觸發掃描，掃描參數為電壓120 kV、電流280 mA、層厚0.75 mm、機架旋轉時間0.28 s、球管旋轉時間0.33 s/r。將圖像信息錄入影像工作站后測定粥樣斑塊的CT值(CT值<60 HU為軟斑塊，60～129 HU為纖維斑塊，≥130 HU為鈣化斑塊)。

1.3.3 血脂檢測：2組患者均取空腹靜脈血，離心取血清，采用全自動生化分析儀檢測低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、小而密低密度脂蛋白膽固醇(sdLDL-C)的含量。

1.3.4 細胞因子檢測： 2組患者均取空腹靜脈血，離心取血清，采用酶聯免疫吸附法測定趨化素(chemerin)、脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(vaspin)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質細胞衍生因子 1α(SDF-1α)的含量。

2 結 果

2.1 2組PCSK9基因V312F位點多態性比較 冠心病組患者PCSK9基因V312F位點TT+TG基因型的比例明顯高于健康對照組，GG基因型的比例明顯低于健康對照組(P<0.01)；T等位基因的比例明顯高于健康對照組，G等位基因的比例明顯低于健康對照組(P<0.01)，見表1。

2.2 不同斑塊性質患者PCSK9基因V312F位點多態性比較 不同斑塊性質患者PCSK9基因V312F位點TT+TG基因型、GG基因型及PCSK9基因V312F位點T等位基因、G等位基因比例比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 不同PCSK9基因V312F位點多態性患者血脂比較 冠心病組中TT+TG基因型患者的血清LDL-C、sdLDL-C、chemerin含量明顯高于GG基因型患者，HDL-C、vaspin含量明顯低于GG基因型患者，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3。

2.4 不同PCSK9基因V312F位點多態性患者細胞因子比較 冠心病組中TT+TG基因型患者血清M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α含量均高于GG基因型患者，差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

3 討 論

LDL-C是冠狀動脈粥樣斑塊的重要成分，體內脂代謝紊亂及炎性反應過度激活均會促進LDL-C在動脈內膜沉積并形成粥樣斑塊。PCSK9是體內調節LDL-C代謝過程的蛋白酶，該蛋白酶通過水解LDLR來阻礙LDL-C代謝，造成LDL-C蓄積，冠心病患者的血清PCSK9含量明顯升高，但引起PCSK9含量升高的機制尚未完全明確?；蚨鄳B性是近年來受到越來越多關注的分子表達調控機制，PCSK9基因被證實在V312F、D320N、E670G等多個位點存在多態性，多態性位點等位基因的突變會造成基因表達發生改變及PCSK9分泌的變化[4-6]。V312F位點的突變類型為等位基因G向T的突變，突變后形成雜合基因型TG及純合基因型TT。為了明確PCSK9基因V312F位點多態性與冠心病發病的關系，本研究首先分析了冠心病患者PCSK9基因V312F位點的基因型及等位基因，結果顯示，冠心病組患者PCSK9基因V312F位點TT+TG基因型的比例、T等位基因的比例明顯高于健康對照組，GG基因型的比例、G等位基因的比例明顯低于健康對照組，提示冠心病患者存在PCSK9基因V312F位點G向T的突變，該多態性與冠心病的發生密切相關。

在動脈粥樣斑塊形成的過程中，LDL-C在動脈內膜沉積，隨著炎性反應的激活，巨噬細胞在動脈內膜大量浸潤、吞噬LDL-C并形成泡沫細胞。LDL-C及泡沫細胞不斷聚集、逐步成為粥樣斑塊[7-8]。冠心病患者體內冠狀動脈粥樣斑塊的性質呈動態變化，在斑塊形成的初期階段、斑塊性質穩定，患者的病情也相對穩定；隨著斑塊體積增大、斑塊內LDL-C增多及斑塊纖維帽在蛋白酶的作用下發生水解，斑塊的穩定性逐步下降，若發生斑塊破裂則會誘發血栓形成、出現心肌梗死。PCSK9直接影響LDL-C的代謝，在明確PCSK9基因V312F位點多態性與冠心病發病的關系后，本研究進一步分析了PCSK9基因V312F位點多態性與冠心病患者斑塊性質的關系，結果發現，不同斑塊性質患者PCSK9基因V312F位點TT+TG基因型、GG基因型的比例及T等位基因、G等位基因的比例有顯著差異，斑塊性質越不穩定，TT+TG基因型的比例及T等位基因的比例越高。這一結果提示冠心病患者體內PCSK9基因V312F位點G向T的突變會影響斑塊性質、使斑塊的穩定性下降。

表1 2組PCSK9基因V312F位點多態性的比較

表2 冠心病組中不同斑塊性質患者PCSK9基因V312F位點多態性的比較

表3 冠心病組中不同PCSK9基因V312F位點多態性患者血脂指標的比較

表4 冠心病組中不同PCSK9基因V312F位點多態性患者血清細胞因子的比較

PCSK9在體內主要參與LDL-C的代謝，LDL-C代謝紊亂會進一步影響其他脂質成分的代謝。LDL-C升高被認為是心腦血管疾病的獨立危險因素，而HDL-C則被認為是心腦血管疾病的保護因素，其功能是促進膽固醇由外周組織向肝臟轉運并通過肝臟代謝膽固醇[9-10]。脂代謝紊亂除了表現為LDL-C和HDL-C的變化外，多種脂肪因子的分泌也發生變化。vaspin和chemerin是2種功能不同的脂肪細胞因子，前者能夠增加胰島素敏感性，具有心血管保護作用，后者能夠拮抗胰島素的生物學活性、具有促炎作用[11-12]。冠心病患者血清中LDL-C及chemerin的含量明顯升高，而HDL-C及vaspin的含量明顯下降。本研究進一步分析了不同PCSK9基因V312F位點多態性冠心病患者脂代謝指標的變化，結果發現，TT+TG基因型患者的血清LDL-C、sdLDL-C、chemerin含量明顯高于GG基因型患者，HDL-C、vaspin含量明顯低于GG基因型患者。這一結果提示冠心病患者體內PCSK9基因V312F位點G向T的突變會影響脂代謝過程。

動脈粥樣斑塊的形成涉及脂代謝紊亂及炎性反應的過度激活，炎性反應激活過程中巨噬細胞在動脈內膜大量浸潤，吞噬LDL-C后成為泡沫細胞并形成粥樣斑塊。炎性細胞因子的瀑布式分泌是炎性反應激活的重要特征，M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α是已知的炎性細胞因子，在冠心病患者血清中的含量明顯升高[13]。M-CSF和TNF-α具有促炎作用，能夠使多種炎性細胞發生活化[14]；IL-6、SDF-1具有趨化活性，能夠促進多種炎性細胞的遷移并向粥樣斑塊浸潤[15-16]。本研究通過分析不同PCSK9基因V312F位點多態性冠心病患者細胞因子的變化發現，TT+TG基因型患者的血清M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α含量明顯高于GG基因型患者。這一結果提示冠心病患者體內PCSK9基因V312F位點G向T的突變會促進炎性細胞因子的分泌，增強患者體內的炎性反應。

綜上所述，冠心病患者PCSK9基因V312F位點存在明顯多態性，具體表現為等位基因G向T的突變；該多態性能夠降低斑塊穩定性，影響冠心病患者體內的脂代謝及細胞因子分泌。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉春燕：負責研究設計、開展和論文撰寫；劉小燕、李平：負責臨床信息收集；陳國才：負責數據統計分析；耿召華：論文撰寫、修改