系統性硬化癥合并肺間質病變患者外周血中IL-8、CXCR1、CXCR2的表達及意義

張帆，韓衛全，龐艷，龔子龍，肖婷，夏露

系統性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是以皮膚和內臟組織呈彌漫性或局限性纖維化進行性硬化的自身免疫性疾病[1]。臨床上以彌漫性或局限性皮膚增厚、內臟(心臟、肺等)器官結構異常、器官缺血為特征性病變[2]。但SSc早期病癥較輕，常被人們忽視而延誤治療時機，導致病情加重。據統計65%以上的SSc患者肺部受到牽連，50%以上患者肺部呈現彌漫性肺間質病變(interstitial lung disease，ILD)，即為SSc-ILD，且ILD成為SSc致死的主要原因[3]。近年來多項研究表明趨化因子與免疫性疾病的發病機制相關[4]。IL-8是由單核細胞、巨噬細胞分泌的單核因子，在炎性反應和免疫反應中具有重要作用。研究表明，IL-8作為趨化因子受體1(CXCR1)、CXCR2的配體，與CXCR1、CXCR2結合后能夠特異性地趨化單核細胞、淋巴細胞聚集到病變部位，引起組織的損傷[5]。多項研究表明，IL-8與受體CXCR2結合，趨化免疫細胞，激活多種炎性因子的表達[6]。但關于IL-8、CXCR1、CXCR2在SSc-ILD中的作用及其與肺功能關系的研究報道較少。本研究通過檢測SSc-ILD患者IL-8、CXCR1、CXCR2水平及免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平，分析IL-8、CXCR1、CXCR2與SSc-ILD發病機制的相關性，為及時有效地診治SSc-ILD提供理論依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年5月武漢市第五醫院風濕免疫科治療的系統性硬化癥患者42例作為研究對象，均符合中華醫學會風濕病學分會制定的SSc診斷標準[7]，其中合并ILD患者25例作為SSc-ILD組，非ILD患者17例作為SSc-非ILD組。另選取同期來院體檢的健康者30例為健康對照組。SSc-ILD組男2例，女23例，年齡22～60(43.75±11.06)歲；病程6個月～11年，平均(47.18±22.19)個月。SSc-非ILD組男3例，女14例，年齡23～60(44.31±10.12)歲；病程6個月～9年，平均(40.55±23.06)個月。健康對照組男5例，女25例，年齡25～65(48.34±10.56)歲。3組研究對象性別、年齡等臨床資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經醫院倫理委員會批準，且受試者及家屬知情同意并自愿簽署同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①SSc-ILD診斷符合Fleischne學會命名委員會關于SSc-ILD的定義；②無其他慢性病史。(2)排除標準：①其他病因引起的肺部病變；②入選前1周服用過激素類藥物。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 肺功能檢測：3組研究對象早晨禁食，采用德國耶格公司生產的SpiroUSB型肺功能儀檢測肺功能，用力肺活量(forced vital capacity，FVC)，第一秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in the first second，FEV1)占預計值百分比(FEV1%)，取測定3次的平均值。

1.3.2 外周血CXCR1、CXCR2 mRNA表達檢測： (1)樣本采集，早晨空腹采集所有受試者靜脈血5 ml，分別置于2個EP管中，一管于含肝素的無菌EP管中用Ficoll Hypaque分離外周血單個核細胞(PBMCs)，一管室溫靜置30 min，離心收集血清，-20℃冰箱保存備用；(2)PBMC制備，取肝素抗凝全血2 ml于10 ml離心管中，加入等體積PBS溶液稀釋，再轉入預先準備的Ficoll Hypaque 4 ml，離心后上層白色即為PBMC；加入RPMI1640完全培養液5～10 ml，2 000 r/min離心10 min，洗滌細胞2次，收集沉淀細胞，并以RPMI1640完全培養液調整細胞為1×106/ml；(3)取調整為1×106/ml的PBMC，依照Trizol試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)使用步驟提取總RNA，紫外分光光度計檢測其吸光度(OD)值，制作標準曲線，計算RNA濃度；將純度良好的RNA按照反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)使用說明反轉錄為cDNA。qRT-PCR反應體系為25 μl，SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10 μl。熒光定量PCR儀反應程序為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。以β-actin為內參基因，使用Primer Premier 5.0設計引物序列，引物序列如表2(委托上海生工公司合成)。反應結束后收集數據，采用2-ΔΔCt算法進行Ct值分析[8]，計算CXCR1和CXCR2的mRNA相對表達量。

表1 3組研究對象臨床資料比較

1.3.3 血清CRP、ESR、IL-8、IgA、IgG、IgM、補體C3水平檢測：上述血清采用ELISA方法檢測白介素-8(IL-8)，試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；采用意大利Vital Microsed-System全自動血沉儀檢測紅細胞沉降率(ESR)，免疫比濁法檢測C反應蛋白(CRP)、IgA、IgG、IgM、補體C3水平。

2 結 果

2.1 3組肺功能比較 SSc-ILD組FEV1%、FEV1/FVC低于SSc-非ILD組低于健康對照組(P均<0.01)，見表3。

表3 3組受試者肺功能比較

2.2 3組CXCR1、CXCR2 mRNA表達水平比較 SSc-ILD組CXCR1、CXCR2 mRNA表達水平高于SSc-非ILD組高于健康對照組(P均<0.01)，見表4。

表4 3組受試者CXCR1、CXCR2mRNA表達水平比較

2.3 3組血清IL-8、ESR、CRP、IgA、IgG、IgM、C3水平比較 SSc-ILD組IL-8、ESR、CRP、IgA、IgG、IgM水平顯著高于SSc-非ILD組高于健康對照組(P均<0.05)， 各組C3水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表2 RT-qPCR引物序列

表5 3組受試者血清中IL-8、ESR、CRP、IgA、IgG、IgM、C3水平比較

2.4 外周血CXCR1、CXCR2、IL-8水平與肺功能的關系 SSc-ILD患者外周血中CXCR1、CXCR2及血清IL-8水平與FEV1%呈負相關(P<0.05)；CXCR1、IL-8與FEV1/FVC呈負相關(P<0.05)，CXCR2與FEV1/FVC無顯著相關性(P>0.05)，見表6。

表6 SSc-ILD患者CXCR1、CXCR2、IL-8與肺功能的相關性

2.5 外周血CXCR1、CXCR2、IL-8水平與相關因子的相關性 SSc-ILD患者CXCR1、CXCR2、IL-8與CRP、ESR、IgA、IgG、IgM均呈正相關(P<0.05)，與C3無顯著相關性(P>0.05)，見表7。

表7 SSc-ILD患者CXCR1、CXCR2、IL-8與CRP、ESR、免疫球蛋白和補體的相關性

3 討 論

SSc是以皮膚炎性反應、纖維化、增厚進而硬化、萎縮為主要特征的風濕性疾病，SSc往往引起肺臟結構異常、肺間質病變[9]。研究發現，ILD是SSc預后不良的主要因素，SSc的發病機制目前尚不清楚，但SSc-ILD的發病與多種免疫細胞、細胞因子、趨化因子等多種因素密切相關[10]。研究發現，中性粒細胞可在機體內釋放細胞因子并作用于CD8+T細胞，并與釋放的相關細胞因子共同參與自身免疫性疾病過程[11]。趨化因子及其受體在炎性反應中具有重要作用，特別與炎性細胞的募集密切相關[12]。目前對于SSc-ILD的早期診斷和治療還缺乏有效的手段。為了明確SSc-ILD發病與機體免疫反應及其趨化作用的關系，本研究主要針對外周血中CXCR1、CXCR2及血清中IL-8在SSc-ILD中的表達水平及與免疫蛋白的關系進行分析。

趨化因子可分為4型，即CXC型、CC型、C型、CX3C型，趨化因子與其特異性的受體結合發揮生物學作用。CXCR1和CXCR2是一條肽鏈的糖蛋白，屬于G蛋白耦聯受體超家族成員，為趨化細胞因子的受體，其與細胞因子的活化、增殖、募集及血管形成前體物質等有關[13]。CXCR1和CXCR2主要表達于單核細胞、中性粒細胞、CD8+T細胞、肥大細胞等細胞表面；IL-8是CXCR1和CXCR2的共同配體，可促進CXC趨化因子的表達，促進中性粒細胞的表達，參與多種疾病的發生發展[14]。本研究結果顯示，SSc-ILD患者外周血單核細胞上的CXCR1、CXCR2 mRNA及血清IL-8表達水平顯著升高，表明IL-8可能通過與其受體結合發揮炎性反應作用。CXCR1和CXCR2與IL-8結合后能夠激活G蛋白耦聯受體通路，介導炎性反應。研究報道，無抗原活性的突變體G31P與IL-8受體CXCR1、CXCR2結合后可抑制中性粒細胞的趨化作用，減輕炎性反應[15]。鱗狀細胞癌患者的皮膚損傷部位中IL-8及其配體CXCR1、CXCR2異常表達[16]。臨床上常結合肺功能檢測評估ILD對肺臟的損傷程度，FVC對于肺間質纖維化病變反應敏感。本研究對患者肺功能指標檢測結果顯示，SSc-ILD組患者FEV1%、FEV1/FVC明顯降低，表明SSc-ILD可能嚴重影響患者的肺功能。進一步進行Spearman相關性分析，結果顯示IL-8、CXCR1、CXCR2與FEV1%、FEV1/FVC密切相關，表明隨著IL-8介導的炎性反應的增強，肺功能受損嚴重。研究表明，IL-8可引起外周血中性粒細胞增加，產生呼吸爆發、溶酶體酶促進肺部炎性反應。

IgA是分泌型蛋白中的主要蛋白，是機體防御中的第一道防線，可介導細胞毒性作用(ADCC)，在免疫性疾病中常升高[17]。研究發現在過敏性紫癜患者中IgA合成增加，促進炎性細胞因子IL-8、TNF-α、IL-6等過度表達，造成腎損傷。IgG約占免疫球蛋白的75%，是血清免疫球蛋白的主要成分[18]。IgM是抗原刺激后機體內最先出現的抗體。研究報道，在系統性紅斑狼瘡、風濕病等免疫性疾病中IgG表達升高，可提高免疫反應[19]。IL-8是重要的促炎細胞因子和中性粒細胞趨化因子，研究報道，在兒童肺炎支原體感染中IL-8促進炎性反應，刺激機體產生自身免疫反應，引起IgG、IgM水平升高[20]。本研究結果顯示，SSc-ILD組患者IgA、IgG、IgM水平顯著升高，C3水平減少，且IL-8、CXCR1、CXCR2均與IgA、IgG、IgM有關，表明SSc-ILD中IL-8引起的炎性反應刺激機體啟動自身免疫應答，引起自身免疫紊亂。CRP在正常機體表達較少，在機體感染和炎性反應時濃度顯著升高，其與ESR是臨床常用的非特異性炎性指標。本研究結果顯示，與SSc-非ILD組和健康對照組比較，SSc-ILD組ESR、CRP水平明顯升高，相關性分析顯示，IL-8、CXCR1、CXCR2與ESR、CRP相關，表明IL-8、CXCR1、CXCR2可能參與機體非特異性炎性反應，引起組織損傷。

綜上所述，SSc-ILD患者血清中趨化因子IL-8、CXCR1、CXCR2表達顯著升高，炎性因子IL-8表達也顯著升高，表明IL-8可能通過其受體CXCR1、CXCR2在SSc-ILD疾病中發揮作用，但其與炎性因子的作用機制，以及與肺功能指標的作用機制有待進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張帆：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；韓衛全：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；龐艷：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；龔子龍、肖婷：進行統計學分析；夏露：課題設計，論文撰寫