血清miR-27與老年2型糖尿病下肢血管病變及25(OH)D3水平的關系

陳云霞，蘇俊平，劉海勇，陳雪，馬瑩

下肢血管病變(lower limb peripheral arterial disease，LLPAD)是外周動脈疾病的主要表現，2型糖尿病是LLPAD的既定危險因素，2型糖尿病患者LLPAD預后差，進展快，血管系統病變范圍更廣，更易形成狹窄和閉塞[1]。2型糖尿病的末梢神經病變導致患者疼痛感喪失和間歇性跛行的頻率降低，即使并發LLPAD，也難被發現，直到病情加重進展，表現為潰瘍或壞疽等LLPAD末期癥狀，最終被迫截肢[2]。微小RNA(miRNA)是一組微小的非編碼單鏈RNA，通過翻譯后mRNA切割或降解來調節基因表達[3]。miR-27在礦物質代謝的調節(磷酸鈣穩態)中起重要作用，促進血清Ca2+水平升高。研究表明，miR-27通過其對血管鈣化和內皮功能障礙的影響誘導動脈粥樣硬化的發生和發展。最近，臨床研究提供了支持循環miR-27水平升高與動脈粥樣硬化性心血管疾病之間關系的證據[4-5]。多項研究表明，血清miR-27水平不僅與亞臨床動脈粥樣硬化有關，而且與冠狀動脈疾病有關，表明miR-27參與動脈粥樣硬化的發生和發展[6]。而關于miR-27與老年2型糖尿病下肢血管病變的研究較少。25-羥維生素D3[25(OH)D3]與骨代謝密切相關。現分析血清miR-27與老年2型糖尿病下肢血管病變及25(OH)D3水平的關系，為老年2型糖尿病下肢血管病變的治療提供依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月—2019年5月河北省滄州市人民醫院內分泌科確診老年2型糖尿病患者86例為T2DM組，符合中國2型糖尿病防治指南(2013年版)的診斷標準[7]，男45例，女41例，年齡60～87(74.85±13.85)歲；病程4～14(9.65±5.41)年；吸煙40例，飲酒35例 。根據是否發生下肢血管病變，分為下肢血管病變(LLPAD)亞組44例和非下肢血管病變(Non-LLPAD) 亞組42例。選擇同期醫院門診健康體檢者76例為對照組，對照組無糖尿病或高血壓家族史，血壓、血脂正常。2組性別、年齡、基礎病、合并癥、BMI、吸煙、飲酒情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經醫院倫理委員會審批通過,所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

表1 對照組、T2DM組臨床資料比較

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①年齡≥60歲，病程均>6個月；②穩定的血糖降低方案至少3個月；③過去6個月內無創傷或手術；④無嚴重的心腦肝腎疾病；⑤代謝穩定至少6個月；⑥在過去1個月內使用血管超聲，下肢血管造影或磁共振成像診斷下肢外周血管疾病，踝臂指數(ankle/brachial index，ABI)<0.9。(2)排除標準：①1型糖尿病，妊娠糖尿病或其他特定類型的糖尿病；②肝腎功能不全；③甲狀腺功能減退癥，急性感染，惡性腫瘤或精神疾病。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 miR-27表達水平檢測：抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 離心5 min，分離血清。采用Trizol Reagent試劑(美國Invitrogen公司)從血清中提取總RNA；BioPhotometer Plus核酸蛋白定量檢測儀(美國賽默飛世爾公司)分析總RNA濃度；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(寶日醫生物技術北京有限公司)進行實時定量PCR。PCR引物的序列如下，miR-27正向引物5'-CTTGATCGCAAGGGTTGAGTCT-3'，反向引物5'-TTGTGTACGTGAGGTGCAGACTGATGC-3'。U6正向引物5'-CCTGTGTGACTGGCTTGTGTGATGC-3'；反向引物5'-TGAGTGCTGACACGAACCTGTGAGT -3'。反應條件為預變性95℃ 30 s、變性 95℃ 5 s、60℃ 44 s，40個循環，61℃時采集熒光，用FX-96實時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)檢測其表達量進行結果分析，以U6作為內參，采用 2-△△Ct法計算miR-27相對表達水平。

1.3.2 血清25(OH)D3測定：抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 離心5 min，分離血清。采用25(OH)D3試劑盒(德國羅氏診斷有限公司)于美國貝克曼AU-580全自動生化分析儀測定血清25(OH)D3。

1.3.3 血生化指標檢測：抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 離心5 min，分離血清，以美國貝克曼AU-580全自動生化分析儀測定空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；美國伯樂680酶標儀測定高敏C反應蛋白(hs-CRP)；Coatron1800全自動凝血分析儀(德國美創公司)測定纖維蛋白原(Fib)。

1.3.4 LLPAD判定：以德國西門子 Acuson SequoiaC512 型彩色多普勒超聲診斷儀檢測患者足背動脈、脛后動脈、脛前動脈、腘動脈、股動脈內徑、斑塊大小及狹窄度；動脈內膜增厚(≥1 mm)，單發、多發、彌漫性斑塊及狹窄(>30%)均為LLPAD。

2 結 果

2.1 各組相關指標比較 與對照組比較，T2DM組miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平升高(P<0.01)，25(OH)D3、HDL-C水平降低(P<0.01)；與Non-LLPAD亞組比較，LLPAD亞組miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平升高(P<0.01)，25(OH)D3、HDL-C水平降低(P<0.01)，見表2。

2.2 miR-27 mRNA與各指標的相關性分析 miR-27 mRNA與25(OH)D3、HDL-C呈負相關(P<0.05)，與TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG呈正相關(P<0.05)，見表3。

表2 各組相關指標比較

表3 miR-27 mRNA與各指標的相關性分析

2.3 老年2型糖尿病合并下肢血管病變發生的多因素Logistic回歸分析 高水平的miR-27 mRNA、TC及低水平的25(OH)D3均為老年2型糖尿病合并下肢血管病變發生的危險因素(OR=2.437、4.268、13.625，P<0.05)，見表4。

2.4 老年2型糖尿病合并下肢血管病變影響因素ROC曲線分析 AUC比較，TC>miR-27 mRNA>25(OH)D3，miR-27 mRNA、25(OH)D3診斷老年2型糖尿病下肢血管病變的敏感度、特異度相近(P>0.05)，均小于TC(P<0.05)；TC、miR-27 mRNA、25(OH)D3的cut-off值為5.432、2.936、24.413 mmol/L；約登指數為0.498、0.364、0.369，見表5、圖1。

3 討 論

糖尿病是嚴重威脅人類健康的疾病之一。下肢血管疾病是常見的糖尿病嚴重并發癥之一，且發病率逐年上升。糖尿病合并下肢血管疾病的主要病理變化是動脈粥樣硬化。據報道，增加的活性氧產物和減少的抗氧化劑在動脈粥樣硬化形成中起重要作用。例如，血清超氧化物歧化酶(SOD)和高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平是2型糖尿病伴下肢血管疾病發病的關鍵。作為抗氧化劑，SOD主要存在于細胞代謝中，通過有毒自由基歧化為無活性的過氧化氫和氧分子在細胞中發揮保護作用[8]。血糖升高可以提高糖基化蛋白的水平。血糖和糖基化蛋白的自身氧化會增加糖尿病患者的自由基水平，抑制抗氧化能力。糖尿病誘導的氧化應激導致內皮細胞損傷。SOD在全身血管疾病中起重要作用。研究表明，miR-27高表達能促進hs-CRP表達，抑制SOD水平。本研究中，T2DM組miR-27 mRNA水平高于對照組；LLPAD亞組miR-27 mRNA水平高于Non-LLPAD亞組，證實了上述結論。

許多證據表明，25(OH)D3在高血糖、胰島素抵抗(IR)和T2DM的發展中也有作用，并且有越來越多的研究已經發現其可以降低全身性炎性反應、免疫反應和脂肪酶的代謝，從而降低患心血管疾病的風險。第三次全國健康和營養檢查調查(NHANES-Ⅲ)發現，與正常濃度25(OH)D3的居民相比，低濃度25(OH)D3的居民外周動脈疾病的發生率更高。本研究中，與對照組比較，T2DM組25(OH)D3平降低；與Non-LLPAD亞組比較，LLPAD亞組25(OH)D3水平降低，這與上述討論一致。25(OH)D3是保護糖尿病患者免于下肢血管疾病發病的一個因素。25(OH)D3可能通過以下機制參與糖尿病下肢血管病變:維生素D可以通過調節胰腺組織中的維生素D受體(VDR)和維生素D依賴性鈣結合蛋白(DBP)來促進胰腺細胞分泌胰島素。它也可通過調節炎性細胞因子和抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達來降低周圍組織的IR。此外，它還可以通過刺激PPARδ和胰島素受體的基因表達來影響胰島素敏感性。骨化三醇可以調節腎素—血管緊張素—醛固酮系統(RAAS)，抑制腎素的表達，調節合成和分泌。維生素D可以上調延遲血管鈣化相關蛋白的表達，包括血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶9。

表4 老年2型糖尿病合并下肢血管病變發生的多因素Logistic回歸分析

表5 老年2型糖尿病合并下肢血管病變影響因素ROC曲線分析

miRNA是長度約為23 nt的內源性小非編碼RNA。血管疾病患者在疾病早期具有某些循環miRNA水平恒定模式。最近的一項研究表明，血管生物學中的不同miRNA可直接或間接地參與血管重塑中基礎基因的轉錄后調控，因此，特定的miRNA可以作為潛在的生物標志物。研究表明，基于miRNA的方法可以抑制增殖性血管平滑肌細胞，可以預防再狹窄，同時選擇性地促進再內皮化和保留內皮細胞功能[9-10]。抑制miR-27表達有助于抑制再狹窄和血栓形成，從而保留內皮功能。miR-27位于17號染色體上，是miRNA家族的一個亞型，具有自己的啟動子區。miR-27的過度表達被證明涉及多種病理狀態，包括癌癥和心血管疾病，并且它可以通過調節特定細胞來影響動脈粥樣硬化的發展[11-12]。miR-27的反義敲低，可以防止頸內動脈球囊損傷后新內膜損傷的形成。miR-27可以通過促進血管生成來加劇動脈鈣化和動脈粥樣硬化的發生，平滑肌細胞增殖，并通過免疫細胞的VDR介導在免疫調節中發揮作用。miR-27過表達會導致血清甲狀旁腺激素(PTH)水平升高。過高的PTH水平可能至少通過增加心臟收縮力和心肌鈣化而部分促進心血管疾病。 miR-27可通過促進炎性細胞因子(如IL-6、TNF-α和CRP)的分泌來加劇動脈壁的慢性炎性反應。

研究表明[13-15]，在外周血管疾病的發病過程中IL-1、PDGF、TNF-α等炎性因子的分泌及細胞外基質(ECM)的沉淀均與25(OH)D3表達呈負相關，同時低度表達的25(OH)D3可通過增加細胞周期蛋白依賴性激酶活性，促進細胞增殖，進而使血管內壁增粗狹窄[16-17]。本結果顯示，miR-27 mRNA與25(OH)D3呈負相關，這與上述結論符合。

本結果發現，高水平miR-27 mRNA為老年2型糖尿病合并下肢血管病變發生的危險因素；miR-27 mRNA、25(OH)D3兩者的AUC相近，均小于TC；miR-27 mRNA、25(OH)D3診斷老年2型糖尿病下肢血管病變的敏感度、特異度相近，均小于TC，說明miR-27、25(OH)D3診斷老年2型糖尿病下肢血管病變具有較高的敏感度、特異度，可作為判定老年2型糖尿病下肢血管病變的生物學標志物。

綜上所述，老年2型糖尿病下肢血管病變患者血清miR-27水平升高，其與25(OH)D3呈顯著負相關；miR-27診斷2型糖尿病下肢血管病變具有較高的敏感度、特異度，可作為判定2型糖尿病下肢血管病變的生物學標志物，值得臨床推廣。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

陳云霞：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；蘇俊平：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；劉海勇：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；陳雪：進行統計學分析；馬瑩：課題設計，論文撰寫