黑水虻抗菌肽的克隆及其生物信息學分析

胡珊珊 陳開莉 陳紅賢 鄔開鑫 尤忠毓

摘要：為了開發新型昆蟲抗菌肽資源，以黑水虻幼蟲為研究對象，采用RT-PCR技術從黑水虻幼蟲總RNA中擴增到一個新型抗菌肽基因DLP-5，并利用在線生物軟件和工具分析了抗菌肽DLP-5的生物信息學特征。結果表明，DLP-5由40個氨基酸殘基組成，分子量為4 226.83 u，等電點為7.87，具有兩親性特征，其中N端為疏水性，C端為親水性，具有3個磷酸化位點，無糖基化位點、信號肽序列和跨膜區。DLP-5的三級結構包含1個N端的loop區、1個α螺旋和1對反向平行β折疊，構成了防御素類抗菌肽典型的“環-螺旋-折疊”結構，說明DLP-5是一個新型的防御素類抗菌肽，可通過與微生物膜相互作用發揮其抗菌活性。

關鍵詞：昆蟲抗菌肽;黑水虻;基因克隆;生物信息學

中圖分類號： S188 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0049-04

昆蟲抗菌肽是昆蟲受到刺激或感染后由體內血淋巴產生的一類小分子堿性多肽，經體內和體外的抗菌活性研究發現，它具有廣譜抗菌活性、分子量小、容易合成、不易形成耐藥性等特性，可作為傳統抗生素的潛在替代抗菌制劑[1-2]。黑水虻（Hermitia illucens L.）是雙翅目水虻科扁角水虻屬的一種資源昆蟲，其幼蟲以動物糞便、腐爛的有機物及植物性垃圾為食，在禽畜糞便及餐廚垃圾的無害化處理中應用前景廣闊[3]。夏嬙等利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌誘導黑水虻幼蟲產生抗菌肽，該抗菌肽可以有效抑制大腸桿菌的生長，穩定性研究發現，黑水虻抗菌肽具有很好的熱穩定性、反復凍融性[4-5]。Park等利用cDNA末端快速擴增技術從黑水虻幼蟲的cDNA中成功克隆了抗菌肽編碼基因DLP1-DLP4[6];Li等在畢赤酵母中重組表達了黑水虻抗菌肽DLP2和DLP4，活性研究表明DLP2和DLP4具有較強的抗菌性能，特別是對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有快速的殺滅活性，其最小殺菌濃度（MIC）為0.01 μmol/L[7]。Elhag等從黑水虻幼蟲的cDNA中篩選到了7種抗菌肽基因[cecropinZ1、sarcotoxin1、sarcotoxin（2a）、sarcotoxin（2b）、sarcotoxin3、stomoxynZH1和stomoxynZH1（a）]，并利用大腸桿菌表達系統成功表達了stomoxynZH1，活性研究表明，重組stomoxynZH1對金黃色葡萄球菌（Staphylococcu saureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）均具有較高的抗菌活性[8]。由此可見，黑水虻及其幼蟲體內含有豐富的內源性抗菌肽，本試驗旨在克隆新型黑水虻抗菌肽，并對其進行生物信息學分析，為進一步開發黑水虻抗菌肽資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Taq Plus DNA Polymerase、柱式動物總RNA抽提純化試劑盒、一步法RT-PCR擴增試劑盒、質粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、E. coli DH5α感受態細胞和克隆載體pUCm-T購買于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑水虻抗菌肽基因的克隆 根據已報道的黑水虻抗菌肽編碼序列[6]，利用Primer Premier 5設計簡并引物HIP-1：5′-GCMACCTGTGAYCTSTTGAGYCC-3′，HIP-2：5′-DYKYCKGCARTTRCAAACRGCTC-3′，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合菌液誘導黑水虻幼蟲產生抗菌肽[5]，采用柱式動物總RNA抽提純化試劑盒提取其幼蟲的總RNA。以總RNA為模板，采用一步RT-PCR擴增試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，并直接擴增出目的片段，反應體系參照試劑盒說明。反應條件：45 ℃ 30 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環;72 ℃ 10 min;4 ℃保持。PCR產物經2%的瓊脂凝膠電泳檢測，采用DNA膠回收試劑盒回收目的基因。將膠回收得到的目的片段與pUCm-T進行連接，連接體系：連接緩沖液1 μL;膠回收產物 7 μL;T4 DNA連接酶1 μL;pUCm-T 1 μL?；旌暇鶆蚝?6 ℃恒溫連接16 h，連接產物轉化至E. coli DH5α感受態細胞中，利用菌落PCR鑒定陽性克隆，利用質粒DNA抽提試劑盒提取陽性克隆的重組質粒送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.2.2 黑水虻抗菌肽基因的生物信息學分析 利用軟件DNAman對測序結果進行分析，查找開放閱讀框;利用NCBI-Blast在線工具對氨基酸序列的相似性進行比對;利用ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對抗菌肽的氨基酸理化性質進行分析;利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析抗菌肽的跨膜結構;利用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析抗菌肽的信號肽;利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）對抗菌肽的疏水性進行分析;利用NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析抗菌肽的磷酸化位點;利用NetOGlyc 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）分析抗菌肽的糖基化位點;利用SWISS-MODEL在線服務（http：//www.swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，構建抗菌肽的三級結構模型。

2 結果與分析

2.1 黑水虻抗菌肽基因的克隆

以菌液浸泡后的黑水虻幼蟲為原料，提取總RNA，利用HIP-1和HIP-2為引物進行一步 RT-PCR 擴增。擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結果發現在120bp左右有特異性條帶（圖1）。將PCR產物膠回收純化后與T載體連接，轉化于E. coli DH-5α感受態細胞中，挑選9個重組子進行培養后提取質粒，并送生工生物工程（上海）有限公司測序。根據測序結果獲得的多肽序列與已知的黑水虻抗菌肽序列比對結果如圖2所示，其中3條序列與文獻報道的黑水虻抗菌肽（DLP-3）序列相同[6]，另有1條的序列與報道序列存在多個氨基酸的差異，將其命名為DLP-5，經NCBI-Blast在線工具比對，未發現與DLP-5完全相同的序列，因此，DLP-5為新抗菌肽序列。

2.2 抗菌肽DLP-5的理化性質

利用ProtParam在線工具對抗菌肽DLP-5的理化性質進行了分析，結果見表1。DLP-5由40個氨基酸殘基組成，其分子式為C173H278N58O54S6，分子量4 226.83 u，等電點7.87。經預測，DLP-5在哺乳動物細胞中的半衰期為4.4 h，在酵母菌和大腸桿菌中的半衰期均大于10 h。DLP-5的親水性平均系數為-0.068，說明其為親水性蛋白。

2.3 抗菌肽DLP-5的跨膜區和信號肽分析

利用TMHMM Server v. 2.0和SignalP 5.0對抗菌肽DLP-5的跨膜結構和信號肽進行分析。結果表明，DLP-5沒有跨膜區和信號肽，因此，抗菌肽DLP-5很可能是位于細胞質中的胞漿蛋白。

2.4 抗菌肽DLP-5的疏水性分析

利用ProtScale工具對抗菌肽DLP-5的疏水性進行了分析，結果如圖3所示，正值為疏水，負值為親水，因此，抗菌肽DLP-5明顯具有兩親性特征，其N端具有疏水性，C端具有親水性。結合親水性平均系數，DLP-5的總體親水性大于疏水性。

2.5 抗菌肽DLP-5的糖基化位點和磷酸化位點分析

蛋白質的糖基化和磷酸化是蛋白質翻譯后常見的加工方式，對蛋白質功能的發揮具有重要影響。利用NetPhos 3.1和NetOGlyc 4.0分別對抗菌肽DLP-5的糖基化位點和磷酸化位點進行了分析，結果表明，在DLP-5分子內沒有糖基化位點，但存在3個磷酸化位點，分別為第2位的蘇氨酸、第7位的絲氨酸和第21位的絲氨酸（圖4）。

2.6 抗菌肽DLP-5的高級結構預測

利用SWISS-MODEL在線服務對抗菌肽 DLP-5 的三級結構進行了同源建模，構建其結構模型，如圖5所示。模型顯示DLP-5包含1個N端的loop區、1個α螺旋和1對反向平行β折疊，三者構成了一個典型的“環-螺旋-折疊”結構。

3 討論

昆蟲抗菌肽因具有抗菌活性高、抗菌譜廣、不易產生抗藥性等特點，越來越受到人們的關注[9]。為了開發新型的昆蟲抗菌肽，本試驗以黑水虻幼蟲為原料，通過反轉錄PCR技術從幼蟲總RNA中擴增得到一條抗菌肽編碼基因，該基因所編碼的多肽DLP-5包含40個氨基酸殘基，與文獻報道的 DLP-1、DLP-2、DLP-3、DLP-4具有較高的同源性[6]。

在獲得DLP-5的氨基酸序列基礎上，本研究進行了系統的生物信息學分析。通過理化性質分析表明，DLP-5屬于帶正電荷的陽離子型抗菌肽，該類抗菌肽通?？勺饔糜趲ж撾姾傻奈⑸锬?，通過桶板模型、毯式模型、超環面模型等方式發揮抗菌作用[10]。此外，在氨基酸組成上，DLP-5含有5個甘氨酸殘基，而富含甘氨酸的抗菌肽大多對革蘭氏陰性菌有著較高的抑菌活性[9]。因此，DLP-5 可能更容易抑制革蘭氏陰性菌的生長。

抗菌肽的疏水性對其抑菌活性有較大影響，適當提高其疏水性，可增強抗菌活性[11]。對DLP-5的疏水性分析表明，DLP-5具有明顯的兩親性特征，其N端的疏水性強，有利于DLP-5與微生物膜的結合，C端的親水性強，有利于DLP-5在水溶液中的溶解性。雖然兩親性結構有利用抗菌肽的抗菌活性，但需要注意的是完全的兩親性結構在提高抗菌活性的同時，也增加了抗菌肽的細胞毒性。

蛋白質的磷酸化是蛋白質翻譯后修飾的重要方式，本試驗發現DLP-5存在3個潛在的磷酸化位點（第2位的蘇氨酸、第7位的絲氨酸和第21位的絲氨酸），這些位點可為其表面修飾的發生提供可能，而實際的磷酸化情況還需進行更深入的研究。

抗菌肽的三級結構對其抑菌活性也有重要影響。本試驗通過同源建模的方式構建了DLP-5的三級結構，結果顯示DLP-5顯現出一種“環-螺旋-折疊”的結構。該結構特征與大多數昆蟲防御素的結構相似，都具有N端loop、單個α-螺旋和2個反平行的-β折疊結構域[12]。因此，DLP-5可能屬于昆蟲防御素類抗菌肽家族。

綜上所述，本試驗通過分子生物學技術從黑水虻幼蟲中克隆了一種新型抗菌肽DLP-5，利用相關生物軟件及在線工具分析了DLP-5的生物信息學特征，為后續DLP-5的基因工程制備奠定了理論基礎，也為深入理解DLP-5的作用機制提供了理論參考。

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