黑水虻抗菌肽的克隆及其生物信息學分析

胡珊珊 陳開莉 陳紅賢 鄔開鑫 尤忠毓

摘要：為了開發(fā)新型昆蟲抗菌肽資源，以黑水虻幼蟲為研究對象，采用RT-PCR技術從黑水虻幼蟲總RNA中擴增到一個新型抗菌肽基因DLP-5，并利用在線生物軟件和工具分析了抗菌肽DLP-5的生物信息學特征。結果表明，DLP-5由40個氨基酸殘基組成，分子量為4 226.83 u，等電點為7.87，具有兩親性特征，其中N端為疏水性，C端為親水性，具有3個磷酸化位點，無糖基化位點、信號肽序列和跨膜區(qū)。DLP-5的三級結構包含1個N端的loop區(qū)、1個α螺旋和1對反向平行β折疊，構成了防御素類抗菌肽典型的“環(huán)-螺旋-折疊”結構，說明DLP-5是一個新型的防御素類抗菌肽，可通過與微生物膜相互作用發(fā)揮其抗菌活性。

關鍵詞：昆蟲抗菌肽;黑水虻;基因克隆;生物信息學

中圖分類號： S188 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0049-04

昆蟲抗菌肽是昆蟲受到刺激或感染后由體內(nèi)血淋巴產(chǎn)生的一類小分子堿性多肽，經(jīng)體內(nèi)和體外的抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，它具有廣譜抗菌活性、分子量小、容易合成、不易形成耐藥性等特性，可作為傳統(tǒng)抗生素的潛在替代抗菌制劑[1-2]。黑水虻（Hermitia illucens L.）是雙翅目水虻科扁角水虻屬的一種資源昆蟲，其幼蟲以動物糞便、腐爛的有機物及植物性垃圾為食，在禽畜糞便及餐廚垃圾的無害化處理中應用前景廣闊[3]。夏嬙等利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌誘導黑水虻幼蟲產(chǎn)生抗菌肽，該抗菌肽可以有效抑制大腸桿菌的生長，穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，黑水虻抗菌肽具有很好的熱穩(wěn)定性、反復凍融性[4-5]。Park等利用cDNA末端快速擴增技術從黑水虻幼蟲的cDNA中成功克隆了抗菌肽編碼基因DLP1-DLP4[6];Li等在畢赤酵母中重組表達了黑水虻抗菌肽DLP2和DLP4，活性研究表明DLP2和DLP4具有較強的抗菌性能，特別是對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有快速的殺滅活性，其最小殺菌濃度（MIC）為0.01 μmol/L[7]。Elhag等從黑水虻幼蟲的cDNA中篩選到了7種抗菌肽基因[cecropinZ1、sarcotoxin1、sarcotoxin（2a）、sarcotoxin（2b）、sarcotoxin3、stomoxynZH1和stomoxynZH1（a）]，并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達了stomoxynZH1，活性研究表明，重組stomoxynZH1對金黃色葡萄球菌（Staphylococcu saureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）均具有較高的抗菌活性[8]。由此可見，黑水虻及其幼蟲體內(nèi)含有豐富的內(nèi)源性抗菌肽，本試驗旨在克隆新型黑水虻抗菌肽，并對其進行生物信息學分析，為進一步開發(fā)黑水虻抗菌肽資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Taq Plus DNA Polymerase、柱式動物總RNA抽提純化試劑盒、一步法RT-PCR擴增試劑盒、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、E. coli DH5α感受態(tài)細胞和克隆載體pUCm-T購買于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑水虻抗菌肽基因的克隆 根據(jù)已報道的黑水虻抗菌肽編碼序列[6]，利用Primer Premier 5設計簡并引物HIP-1：5′-GCMACCTGTGAYCTSTTGAGYCC-3′，HIP-2：5′-DYKYCKGCARTTRCAAACRGCTC-3′，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合菌液誘導黑水虻幼蟲產(chǎn)生抗菌肽[5]，采用柱式動物總RNA抽提純化試劑盒提取其幼蟲的總RNA。以總RNA為模板，采用一步RT-PCR擴增試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，并直接擴增出目的片段，反應體系參照試劑盒說明。反應條件：45 ℃ 30 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保持。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂凝膠電泳檢測，采用DNA膠回收試劑盒回收目的基因。將膠回收得到的目的片段與pUCm-T進行連接，連接體系：連接緩沖液1 μL;膠回收產(chǎn)物 7 μL;T4 DNA連接酶1 μL;pUCm-T 1 μL。混合均勻后16 ℃恒溫連接16 h，連接產(chǎn)物轉化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，利用菌落PCR鑒定陽性克隆，利用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒提取陽性克隆的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.2.2 黑水虻抗菌肽基因的生物信息學分析 利用軟件DNAman對測序結果進行分析，查找開放閱讀框;利用NCBI-Blast在線工具對氨基酸序列的相似性進行比對;利用ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對抗菌肽的氨基酸理化性質(zhì)進行分析;利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析抗菌肽的跨膜結構;利用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析抗菌肽的信號肽;利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）對抗菌肽的疏水性進行分析;利用NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析抗菌肽的磷酸化位點;利用NetOGlyc 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）分析抗菌肽的糖基化位點;利用SWISS-MODEL在線服務（http：//www.swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，構建抗菌肽的三級結構模型。

2 結果與分析

2.1 黑水虻抗菌肽基因的克隆

以菌液浸泡后的黑水虻幼蟲為原料，提取總RNA，利用HIP-1和HIP-2為引物進行一步 RT-PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結果發(fā)現(xiàn)在120bp左右有特異性條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物膠回收純化后與T載體連接，轉化于E. coli DH-5α感受態(tài)細胞中，挑選9個重組子進行培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并送生工生物工程（上海）有限公司測序。根據(jù)測序結果獲得的多肽序列與已知的黑水虻抗菌肽序列比對結果如圖2所示，其中3條序列與文獻報道的黑水虻抗菌肽（DLP-3）序列相同[6]，另有1條的序列與報道序列存在多個氨基酸的差異，將其命名為DLP-5，經(jīng)NCBI-Blast在線工具比對，未發(fā)現(xiàn)與DLP-5完全相同的序列，因此，DLP-5為新抗菌肽序列。

2.2 抗菌肽DLP-5的理化性質(zhì)

利用ProtParam在線工具對抗菌肽DLP-5的理化性質(zhì)進行了分析，結果見表1。DLP-5由40個氨基酸殘基組成，其分子式為C173H278N58O54S6，分子量4 226.83 u，等電點7.87。經(jīng)預測，DLP-5在哺乳動物細胞中的半衰期為4.4 h，在酵母菌和大腸桿菌中的半衰期均大于10 h。DLP-5的親水性平均系數(shù)為-0.068，說明其為親水性蛋白。

2.3 抗菌肽DLP-5的跨膜區(qū)和信號肽分析

利用TMHMM Server v. 2.0和SignalP 5.0對抗菌肽DLP-5的跨膜結構和信號肽進行分析。結果表明，DLP-5沒有跨膜區(qū)和信號肽，因此，抗菌肽DLP-5很可能是位于細胞質(zhì)中的胞漿蛋白。

2.4 抗菌肽DLP-5的疏水性分析

利用ProtScale工具對抗菌肽DLP-5的疏水性進行了分析，結果如圖3所示，正值為疏水，負值為親水，因此，抗菌肽DLP-5明顯具有兩親性特征，其N端具有疏水性，C端具有親水性。結合親水性平均系數(shù)，DLP-5的總體親水性大于疏水性。

2.5 抗菌肽DLP-5的糖基化位點和磷酸化位點分析

蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后常見的加工方式，對蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮具有重要影響。利用NetPhos 3.1和NetOGlyc 4.0分別對抗菌肽DLP-5的糖基化位點和磷酸化位點進行了分析，結果表明，在DLP-5分子內(nèi)沒有糖基化位點，但存在3個磷酸化位點，分別為第2位的蘇氨酸、第7位的絲氨酸和第21位的絲氨酸（圖4）。

2.6 抗菌肽DLP-5的高級結構預測

利用SWISS-MODEL在線服務對抗菌肽 DLP-5 的三級結構進行了同源建模，構建其結構模型，如圖5所示。模型顯示DLP-5包含1個N端的loop區(qū)、1個α螺旋和1對反向平行β折疊，三者構成了一個典型的“環(huán)-螺旋-折疊”結構。

3 討論

昆蟲抗菌肽因具有抗菌活性高、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，越來越受到人們的關注[9]。為了開發(fā)新型的昆蟲抗菌肽，本試驗以黑水虻幼蟲為原料，通過反轉錄PCR技術從幼蟲總RNA中擴增得到一條抗菌肽編碼基因，該基因所編碼的多肽DLP-5包含40個氨基酸殘基，與文獻報道的 DLP-1、DLP-2、DLP-3、DLP-4具有較高的同源性[6]。

在獲得DLP-5的氨基酸序列基礎上，本研究進行了系統(tǒng)的生物信息學分析。通過理化性質(zhì)分析表明，DLP-5屬于帶正電荷的陽離子型抗菌肽，該類抗菌肽通常可作用于帶負電荷的微生物膜，通過桶板模型、毯式模型、超環(huán)面模型等方式發(fā)揮抗菌作用[10]。此外，在氨基酸組成上，DLP-5含有5個甘氨酸殘基，而富含甘氨酸的抗菌肽大多對革蘭氏陰性菌有著較高的抑菌活性[9]。因此，DLP-5 可能更容易抑制革蘭氏陰性菌的生長。

抗菌肽的疏水性對其抑菌活性有較大影響，適當提高其疏水性，可增強抗菌活性[11]。對DLP-5的疏水性分析表明，DLP-5具有明顯的兩親性特征，其N端的疏水性強，有利于DLP-5與微生物膜的結合，C端的親水性強，有利于DLP-5在水溶液中的溶解性。雖然兩親性結構有利用抗菌肽的抗菌活性，但需要注意的是完全的兩親性結構在提高抗菌活性的同時，也增加了抗菌肽的細胞毒性。

蛋白質(zhì)的磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式，本試驗發(fā)現(xiàn)DLP-5存在3個潛在的磷酸化位點（第2位的蘇氨酸、第7位的絲氨酸和第21位的絲氨酸），這些位點可為其表面修飾的發(fā)生提供可能，而實際的磷酸化情況還需進行更深入的研究。

抗菌肽的三級結構對其抑菌活性也有重要影響。本試驗通過同源建模的方式構建了DLP-5的三級結構，結果顯示DLP-5顯現(xiàn)出一種“環(huán)-螺旋-折疊”的結構。該結構特征與大多數(shù)昆蟲防御素的結構相似，都具有N端loop、單個α-螺旋和2個反平行的-β折疊結構域[12]。因此，DLP-5可能屬于昆蟲防御素類抗菌肽家族。

綜上所述，本試驗通過分子生物學技術從黑水虻幼蟲中克隆了一種新型抗菌肽DLP-5，利用相關生物軟件及在線工具分析了DLP-5的生物信息學特征，為后續(xù)DLP-5的基因工程制備奠定了理論基礎，也為深入理解DLP-5的作用機制提供了理論參考。

參考文獻：

[1]Tonk M，Vilcinskas A. The medical potential of antimicrobial peptides from insects [J]. Current Topics in Medicinal Chemistry，2017，17（5）：554-575.

[2]Wu Q，Pato cˇka J，Ku cˇa K. Insect antimicrobial peptides，a mini review [J]. Toxins，2018，10（11）：E461.

[3]da Silva G D P，Hesselberg T. A review of the use of black soldier fly larvae，Hermetia illucens （Diptera：Stratiomyidae），to compost organic waste in tropical regions [J]. Neotropical Entomology，2020，49（2）：151-162.

[4]夏 嬙，趙啟鳳，廖 業(yè)，等. 黑水虻抗菌肽粗提物生物學穩(wěn)定性觀察[J]. 山東醫(yī)藥，2013，53（36）：91-92.

[5]夏 嬙，趙啟鳳，廖 業(yè)，等. 黑水虻抗菌肽誘導條件優(yōu)化及粗提物活性研究[J]. 環(huán)境昆蟲學報，2013，35（1）：44-48.

[6]Park S I，Kim J W，Yoe S M. Purification and characterization of a novel antibacterial peptide from black soldier fly （Hermetia illucens） larvae [J]. Developmental and Comparative Immunology，2015，52（1）：98-106.

[7]Li Z，Mao R，Teng D，et al. Antibacterial and immunomodulatory activities of insect defensins-DLP2 and DLP4 against multidrug-resistant Staphylococcus aureus[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：12124.

[8]Elhag O，Zhou D，Song Q，et al. Screening，expression，purification and functional characterization of novel antimicrobial peptide genes from Hermetia illucens （L.） [J]. PLoS One，2017，12（1）：e0169582.

[9]王 龍，馮 群，高嘉敏，等. 昆蟲抗菌肽分類及在醫(yī)學中應用[J]. 環(huán)境昆蟲學報，2017，39（6）：1387-1396.

[10]張冰清，杭柏林，夏一赫，等. 牛血紅蛋白源抗菌肽BHP的生物信息學分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（17）：17-19.

[11]趙連靜，黃宜兵，高 嵩，等.螺旋型抗菌肽的疏水性對抗細菌與抗真菌活性的影響比較[J]. 中國科學（化學），2013，43（8）：1041-1050.

[12]Koehbach J. Structure-activity relationships of insect defensins [J]. Frontiers in Chemistry，2017，5：45.許 哲，張晨光，張思遠，等. 二倍體和四倍體西瓜的轉錄組初步分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（24）：53-59.