基于UPLC-QTOF/MS的藍莓果實發育代謝組學差異分析

王倩 張長青 李廣平 李海玲 趙輝

摘要：藍莓做為深受消費者喜愛的一種新興高經濟價值水果，果實風味、色澤和果皮厚度等直接影響其商品品質。為探究果實成熟期間各小分子物質變化對果品品質的影響，通過高效液相色譜及質譜分析，從代謝組學水平對成熟果實中小分子化合物通路成分和變化進行研究。以幼果為對照，共篩選出858個差異離子，其中414個為上調，444個為下調。經KEGG數據庫通路注釋，鑒定出294種差異代謝物，可分為13大類，其中苯丙酯類和聚酶化合物數量最多，達61種，占總數的20.6%，其次是有機含氧化合物與脂類和類脂分子，各有48種，這些代謝物涵蓋了糖類、有機酸、氨基酸、脂類和胺類等化合物。該結果有助于揭示藍莓果實成熟的生理發育機制，可為高品質藍莓的培育提供參考。

關鍵詞：藍莓;代謝組學;果實發育;通路分析

中圖分類號：S663.901 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0148-05

藍莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）果樹，又名越橘。其果實為藍色漿果，具有白色果粉，味道酸甜并帶有芳香氣味。同時藍莓果實富含花青素、多酚等物質，因而具有較強的抗氧化能力，深受消費者喜愛，是具有較高經濟價值和廣闊前景的果樹樹種[1]。近些年我國科研單位陸續開展藍莓果樹的研究與利用，推動了我國藍莓產業的快速發展。目前南方主栽品種主要為兔眼藍莓和南高叢藍莓，多數存在果實小、風味淡、口感不佳等問題。華星等研究發現隨著藍莓果實發育，總酚和總黃酮等物質含量呈先下降再升高的趨勢，同時己糖、葡萄糖和果糖的積累可以促進花色苷的形成[2]。

代謝組學全譜分析是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關系的研究技術，其研究對象是相對分子質量小于1 000 u的小分子物質，如脂類、酮類和有機酸等[3]。使用代謝組學分析樣本不僅能系統地分析主要差異物的影響，還能對一些常規分析方法難以檢測到的物質進行檢測，因此是開展生理差異分析的重要手段。代謝組分析可以從大量代謝物中篩選出具有統計學和生物學意義的差異代謝物，并以此為基礎闡明生物體的代謝過程和變化機制差異[4-5]。隨著基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等組學技術的迅速發展，組學研究方法被應用于果實發育與成熟的研究中，但藍莓中相關研究較少。由于藍莓的高營養價值，研究人員對其營養成分、抗氧化活性物質等研究較為深入。但利用高效液相色譜串聯質譜技術，對藍莓果實發育過程中代謝物質進行組學分析，從差異代謝物及代謝途徑等方面進行闡述的研究甚少。

為研究藍莓果實成熟期間各小分子物質變化對果品品質的影響，本研究通過高效液相色譜串聯質譜技術，從代謝組學水平對成熟果實中小分子化合物組分差異和通路成分進行分析，以期為藍莓果實發育代謝組學研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設計

以金陵科技學院園藝實驗站種植的兔眼藍莓（Vaccinium ashei）品種“粉藍”為試材，樹齡達10年以上，分別在果實膨大期（直徑5 mm）和成熟期采集果實樣本。對于每個樣品均等分成4份，每份100 g，用干冰儲藏運送進行代謝物提取。

1.2 方法

1.2.1 代謝物提取 樣品采用有機試劑沉淀蛋白法進行代謝物提取，具體過程如下：經-80 ℃保存的果實樣品先放置于-20 ℃環境下30 min，再放置于4 ℃冰箱解凍。向每個樣品管中添加 800 μL 冷凍后的甲醇 ∶ 水（體積比為1 ∶ 1）緩和溶液。在每個樣品管中分別加入2個鋼珠，利用組織研磨器進行充分研磨，設置參數為50 Hz，5 min;取出鋼珠，將離心管放置在-20 ℃冰箱中沉淀2 h，然后在4 ℃、30 000 g條件下離心15 min。分別從每個樣品中取出650 μL放入新樣品管中，并在 4 ℃、25 000 g條件下離心15 min，然后從每個樣品中取出550 μL放入新樣品管中，按照順序將樣品放置保存。最后，每個樣品取30 μL混合，制成質量控制（QC）樣品，進行質譜數據采集。

1.2.2 代謝物分離 用質控（QC）樣品平衡儀器后，采用超高效液相色譜系統（Waters，UK）進行色譜分離，色譜柱溫度保持在50 ℃，流速為 0.4 mL/min，其中流動相A為水和0.1%甲酸，流動相B為甲醇和0.1%甲酸。對代謝物使用以下梯度洗脫：0～2 min，100%流動相A;2～11 min，0～100%流動相B;11～13 min，100%流動相B;13～15 min，0～100%流動相A。每個樣品的上樣體積為10 μL。

1.2.3 代謝物檢測 用高分辨率串聯質譜儀Xevo G2-XS QTOF （Waters，UK）對色譜柱上洗脫下來的小分子代謝物進行正負離子模式檢測。對于正離子模式，毛細管電壓和取樣錐電壓分別設置為3.0 kV和40.0 V;對于負離子模式，毛細管電壓和取樣錐電壓分別設置為2.0 kV和40.0 V。用質心均方誤差模式進行質心數據采集。一級掃描范圍為50～1 200 u，掃描時間為0.2 s。用20～40 eV的能量對所有母離子進行碎片化，掃描時間為0.2 s。在數據采集過程中，每3 s對亮氨酸腦啡肽信號進行1次實時質量校正。同時，每隔10個樣品進行1次質量控制樣品采集，用來評估樣品數據采集過程中儀器狀態的穩定性。

1.3 數據分析

使用軟件Progenesis QI （version 2.2）對質譜下機數據進行峰對齊、峰提取和峰鑒定等[6-7]。單變量分析采用t檢驗和變異倍數分析（fold change analysis，FC analysis），多變量分析采用無監督的主成分分析方法（principal component analysis，PCA）。采用單變量分析差異倍數（fold change）和q值來篩選差異表達的代謝物，以差異倍數≥1.2 或≤0.833 3，q-value 值小于0.05作為篩選差異代謝物的條件。使用R軟件中的pheatmap包中的pheatmap函數進行聚類分析，并基于KEGG數據庫進行代謝物代謝通路注釋。

2 結果與分析

2.1 差異代謝物檢測分析

通過變異倍數分析（FC）和火山圖（圖1），可直觀顯示出2組代謝物間變化的顯著性，從而篩選差異性代謝物。篩選條件為FC值小于等于0.833 3或大于等于1.2，且q-value值小于0.05。圖1為成熟果實和幼嫩果實組織間正離子模式下的火山圖，log2 （fold change）為橫坐標，q-value的負對數-lg（q-value）為縱坐標，紅點為篩選出的差異表達的代謝物。

代謝組學分析中，主成分分析（PCA）主要用于觀察實驗模型中的組間分離趨勢，是否有異常點出現，以及反映組間和組內變異度的分析技術。PCA分析結果（圖2）表明，2個處理的4次重復在得分圖中分布較為集中，表明每個處理內差異較小，本次試驗的穩定性比較好。紅色標注為成熟果實4個樣本，藍色標注為幼嫩果實4個樣本。橫坐標為第一主成分PC1，由圖可知該主成分能綜合原始信息的比例為45.01%，縱坐標為第二主成分PC2，該主成分能綜合原始信息的比例為20.2%。成熟果實和幼嫩果實2組間PCA得分差異顯著，相距較遠，且處于95%置信區間內，表明2個組分間的代謝產物存在較大的差異。

2.2 差異離子聚類分析

在正離子模式條件下，提取峰后共得到 1 784個差異離子，經一級數據搜索數據庫后鑒定到1 150個差異離子，其中527個為上調，623個為下調;經數據庫理論二級碎片搜索后鑒定到858個差異離子，其中414個為上調，444個為下調。對篩選出來的離子進行聚類分析，結果如圖3所示。

2.3 差異代謝物通路分析

通過代謝通路分析能夠更好地了解代謝物所參與的主要生化代謝途徑和信號轉導通路[8]，基于KEGG數據庫進行代謝物代謝通路注釋，共鑒定出294種代謝物，可分為13大類，詳見圖4。苯丙酯類和聚酮化合物最多，達61種（占總差異物的20.6%），其次是有機含氧化合物與脂類和類脂分子相同，均為48種（各占總差異物的16.2%），苯環類化合物為44種（占總差異物的14.9%），有機雜環化合物為43種（占總差異物的14.5%），有機酸及其衍生物為37種（占總差異物的12.5%），涵蓋了糖類、有機酸、氨基酸、脂類和胺類等化合物。

這些差異代謝物參與了果實發育過程中不同的生物代謝途徑[9-10]，由圖5可見，共有40個差異代謝物參與了賴氨酸降解過程。其中L-2-氨基己二酸6-半醛、6-氨基-2-氧代己酸甲酯和5-氨基戊酸鹽作為生物素關鍵因素對L-賴氨酸降解發揮較大的促進調控作用。6-乙酰氨基-2-氧代己酸甲酯起抑制作用，需氧菌素對于果實發育的調控作用尚不明確。

3 討論

賴氨酸在脫羧酶的作用下發生脫羧反應可生成1，5-戊二胺（又稱為尸胺），有研究表明戊二胺可以作為第二信使調控植物衰老過程，并能促進雌蕊和雄蕊的發育，外源添加戊二胺可以改善坐果和促進果實發育。同時戊二胺也是生物合成喹嗪堿的前體，而喹嗪堿在調節植物新陳代謝和合成次級代謝產物方面也起著重要的作用。一般來說，隨著果實的成熟，胺類物質積累量會逐漸減少[11]。本研究中關于藍莓胺類物質的研究結果支持了這一觀點。在成熟果實中，多胺含量，包括Spd、Spm、4-氨基丁烷和tSpm等，均較幼果低。

代謝組學是通過分析海量代謝物信息，來探究生物體內源性代謝物整體及其變化規律的科學。海量信息的獲取不僅受提取方法的影響，還受檢測儀器的分辨率等因素的影響。代謝組學常用高分辨檢測技術有 GC-MS 和LC-MS，與 LC-MS 相比，GC-MS 不宜進行熱不穩定代謝物的分析，且樣品前處理需衍生化，不僅操作繁瑣、耗時，還可能引入干擾物[12]，對組學分析產生誤差。LC-MS 技術雖較晚應用到代謝組學中，但具有檢測范圍廣，適用于熱不穩定代謝物，前處理簡單，基本不需要衍生化等優點。本研究采用的 QTOF（飛行時間質譜）技術，是目前使用較普遍的代謝組學質譜分析儀器，準確度能達到1×10-6 mg/L，通過與超高壓液相色譜聯用，掃描速度快，為代謝物的定性分析提供更多依據[13]。本試驗通過高效液相色譜結合串聯質譜分析，揭示了在果實成熟中賴氨酸降解的代謝通路中各小分子化合物的作用，研究結果拓展了人們關于藍莓小分子代謝物的認知和應用。

參考文獻：

[1]孫海悅，李亞東. 世界藍莓育種概述 [J]. 東北農業大學學報，2014，45（9）：116-22.

[2]華 星，侯智霞，蘇淑釵. 藍莓果實關鍵品質的形成特性 [J]. 經濟林研究，2012，30（1）：108-113.

[3]戴宇樵，呂才有. 代謝組學技術在茶學中的應用研究進展 [J]. 江蘇農業科學，2019，47（2）：24-28.

[4]Fortes A M，Agudelo-Romero P. Polyamine metabolism in climacteric and non-climacteric fruit ripening [J]. Methods Mol Biol，2018，1694：433-447.

[5]Poidevin L，Unal D，Belda-Palazon B，et al. Polyamines as quality control metabolites operating at the post-transcriptional level [J]. Plants，2019，8（4）：109-121.

[6]Wen B，Mei Z L，Zeng C W，et al. MetaX：a Flexible and comprehensive software for processing metabolomics data [J]. BMC?Bioinformatics，2017，18（1）：183-196.

[7]Dunn W B，Broadhurst D，Begley P，et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry [J]. Nature Protocols，2011，6（7）：1060-1083.

[8]Chen X，Qiu L，Guo H，et al. Spermidine induces physiological and biochemical changes in southern highbush blueberry under drought stress [J]. Brazilian Journal of Botany，2017，40：841-851.

[9]Lasanajak Y，Minocha R，Minocha SC，et al. Enhanced flux of substrates into polyamine biosynthesis but not ethylene in tomato fruit engineered with yeast S-adenosylmethionine decarboxylase gene [J]. Amino Acids，2014，46（3）：729-742.

[10]陳志遠，趙冠杰，魏若男. 藍莓果實發育期內源精胺的CE-ECL分析及與保鮮品質的關系 [J]. 分子植物育種，2019，17（7）：2356-2362.

[11]Kushad M M，Yelenosky G，Knight R. Interrelationship of polyamine and ethylene biosynthesis during avocado fruit development and ripening [J]. Plant Physiology，1988，87（2）：463-467.

[12]常玉瑋，王國棟. LC-MS 在植物代謝組學分析中的應用 [J]. 生命科學，2015，27（5）：978-985.

[13]孔宏偉，戴偉東，許國旺. 基于液相色譜-質譜聯用的代謝組學研究中代謝物的結構鑒定進展 [J]. 色譜，2014，32（10）：1052-1057. 郭 雙，劉 華，羅 昌，等. 4個芳香菊品種花、葉香氣成分的HS-SPME/GC-MS分析[J]. 江蘇農業科學，2020，48（24）：198-207.