鄭州鯉養(yǎng)殖場鯉急性爛鰓病的癥狀與病原鑒定

吳玲梅 溫智清 楊雪冰 董國棟 李旭東 王飛 鄭曉聰 劉葒 賈鵬 毛明光

摘要：2019年6月，河南鄭州某鯉養(yǎng)殖場發(fā)生鯉急性爛鰓病，累計死亡率約40%。為研究發(fā)病病因和疾病流行規(guī)律，對病魚解剖，進行細菌和寄生蟲檢測、組織病理學檢測、PCR檢測和系統(tǒng)進化分析。結果顯示，病魚體表黏液增多，眼球凹陷，頭蓋骨凹凸不平，鰓腫脹并伴有潰爛，腎臟腫大至鰾間隔。體視鏡下可見病魚鰓絲末端鈍圓、呈棒狀，鰓絲間充滿大量黏液。組織病理學檢查可見病魚鰓絲和鰓小片組織結構嚴重受損，鰓絲上皮細胞增生、壞死脫落，鰓弓遠端和近端鰓小片均有明顯增生且相互融合。PCR方法從病魚中檢出鯉浮腫病毒（carp edema virus，CEV），而SVCV和KHV檢測結果為陰性。另外，病魚體表和鰓并未見任何寄生蟲，細菌學檢測也未分離到任何與鯉爛鰓病相關的病原菌。遺傳進化分析表明，此次檢出的CEV毒株屬于Ⅱa基因亞型，且與中國分離株（AS1、WJ2016）及日本分離株（CyPP3）的同源性最高，約為98.8%。初步推斷Ⅱa基因亞型CEV可能是引起此次鄭州鯉急性爛鰓病的主要病因，后續(xù)養(yǎng)殖中需加強對該病進行防控。

關鍵詞：鯉急性爛鰓病;鯉浮腫病毒;癥狀;病原鑒定

中圖分類號：S941.42+4 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0167-06

2018年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)總產(chǎn)量達4 991.06萬t，約占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%，是世界上唯一水產(chǎn)品養(yǎng)殖總量超過捕撈總量的漁業(yè)國家。鯉魚作為我國第四大淡水養(yǎng)殖品種，2018年總產(chǎn)量達到296.2萬t[1]，是我國消費者動物性蛋白的主要來源之一。河南省作為黃河鯉養(yǎng)殖大省，其2018年產(chǎn)量約23.0萬t，居全國第三。然而，老病新發(fā)、外來病和新發(fā)疫病等情況成為鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，例如鯉春病毒血癥（spring viraemia of carp，SVC）和錦鯉皰疹病毒病（koi herpes virus disease，KHVD）等老病以及鯉急性爛鰓病等新發(fā)疫病[2]。鯉急性爛鰓病作為一種新發(fā)疫病，自2003年在河南地區(qū)出現(xiàn)以來，逐漸在河南鯉養(yǎng)殖體系廣泛流行，養(yǎng)殖池塘發(fā)病率約60%，單個池塘累計死亡率為50%～80%[3-4]，對當?shù)仵庰B(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。2013年洛陽市因該病造成約1 000 t鯉死亡，損失上千萬元[3]。然而，對于這種新發(fā)疫病，無論鯉養(yǎng)殖從業(yè)者還是魚病研究人員均未能提出有效防控措施，究其原因是該病的病原尚不明確。2019年6月，鄭州某鯉養(yǎng)殖場暴發(fā)鯉急性爛鰓病，本研究采集樣品后對其進行初步分析，以探究其發(fā)病原因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月，河南省鄭州市某鯉養(yǎng)殖場暴發(fā)鯉急性爛鰓病，發(fā)病鯉體質(zhì)量400～500 g，累計死亡率約40%，發(fā)病水溫23 ℃。隨機采集10尾瀕死鯉，低溫保存帶至實驗室作進一步分析。

1.2 細菌和寄生蟲檢測

肉眼檢查病魚體表、鰓、肝臟、腸道等組織是否有寄生蟲。同時對鰓絲制備組織壓片，在光學顯微鏡下進行寄生蟲觀察。

無菌條件下，用無菌環(huán)從病魚腎臟和肝臟挑取樣品，劃線接種于BHIA平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌生長情況。

1.3 鰓絲病理觀察

取部分病魚鰓置于含有生理鹽水的平皿中，輕輕漂洗1次，將其轉移至新的生理鹽水中，置于體視鏡（Leica，德國）下進行形態(tài)觀察。同時，采集健康鯉的鰓作為對照。

1.4 組織病理學檢測

采集病魚的鰓組織樣本，切成約5 mm×5 mm組織塊，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。固定組織經(jīng)水洗、乙醇梯度脫水、甲苯透明、石蠟浸泡后包埋呈石蠟組織塊。在常溫下，采用Leica組織切片機進行連續(xù)切片（厚度5 μm），載玻片貼附37 ℃過夜后HE染色。切片經(jīng)二甲苯脫蠟-乙醇梯度復水-水洗-蘇木素染色-分化藍化-伊紅復染-乙醇梯度脫水-二甲苯透明-樹脂膠包埋-膠包70 ℃烤片48 h。HE染色結果為細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈紅色，脂滴和水泡不著色。染色結果經(jīng)光學顯微鏡（Zeiss，美國）觀察并拍照記錄。

1.5 PCR檢測

采集病魚的鰓、腦、腎臟和脾臟混合并勻漿，取約30 mg用于核酸抽提。使用TaKaRa MiniBEST viral RNA/DNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）提取總核酸（DNA和RNA），操作步驟詳見試劑盒說明書。總核酸用于檢測CEV、KHV和SVCV，PCR引物和擴增靶基因見表1。CEV套式PCR體系和反應條件參見溫智清等的研究方法[5]。KHV和SVCV檢測參考《水生動物疾病診斷手冊》“2.3.7”章[6]和“2.3.9”章[7]。PCR檢測樣品設置2個復孔，并設立陰性對照和陽性對照。

1.6 電泳和測序分析

使用QIAxcel 全自動凝膠電泳儀（QIAgen，德國）對PCR產(chǎn)物進行電泳分析。PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進行測序。使用clustal W生物學軟件megalign方法對共計31條CEV序列進行比對，使用MEGA X生物學軟件maximum likelihood method中的Tamura 3-parameter模型進行遺傳進化分析，序列之間比對1 000次。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

發(fā)病魚主要的臨床癥狀為在水面聚集慢游，鰓腫脹并潰爛（圖1-A），唇與鼻之間凹陷、頭骨凹凸不平（圖1-B），眼睛凹陷（圖1-C），腎臟腫大至鰾間隔（圖1-D）。

2.2 細菌和寄生蟲檢測

將挑去的肝臟和腎臟組織樣品置于BHIA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，未見優(yōu)勢菌落生長。病魚體表和鰓絲壓片觀察未見寄生蟲。

2.3 鰓絲病變

正常鯉鰓絲末端呈尖狀，形態(tài)清晰，且無白色黏液（圖2-A）。體視鏡下，可見病魚鰓絲末端鈍圓，呈棒槌狀，形態(tài)不清，鰓絲周圍附有白色絮狀黏液（圖2-B）。

2.4 組織病理變化

組織病理學結果表明，健康鯉鰓絲組織結構正常，鰓小片呼吸上皮細胞偶見空泡變性，鰓絲和鰓小片毛細血管豐富，偶見上皮細胞脫落（圖3-A）。患病魚鰓絲、鰓小片組織結構嚴重受損，鰓絲上皮細胞增生、壞死脫落，鰓弓遠端和近端鰓小片均有明顯增生，相互融合（圖3-B）。

2.5 PCR檢測

PCR檢測結果表明，KHV和SVCV未見特異性擴增，檢測結果均為陰性;CEV套氏PCR第一步PCR和第二步PCR分別擴增出528 bp和478 bp大小的目的條帶，表明CEV PCR檢測結果呈陽性（圖4）。

2.7 CEV序列分析

對CEV第一步PCR產(chǎn)物進行測序，并以CEV P4a的357 bp基因片段進行遺傳進化分析。結果表明，此次河南鄭州檢測到的CEV 20190530株屬于Ⅱa基因亞型（圖5），并且和中國分離株（AS1和WJ2016）和日本分離株（CyPP3）同源性最高，約為98.8%。

3 討論

根據(jù)病原和導致臨床癥狀的不同，通常將鯉急性爛鰓病分為寄生蟲性爛鰓、細菌性敗血癥性爛鰓和腎炎型急性爛鰓3種[3]。寄生蟲性爛鰓常見于黏孢子蟲[9]、指環(huán)蟲、車輪蟲[10]和三代蟲[11]等引起的爛鰓病，肉眼可見病魚體表、內(nèi)臟或鰓上的寄生

蟲，鰓上附有白點狀的黏孢子蟲包囊，顯微鏡下可見包囊中有大量孢子[12]。細菌性敗血癥性爛鰓主要是由柱狀屈橈桿菌[11]和柱狀黃桿菌[13]等引起，可分為慢性爛鰓和急性爛鰓，普通鯉、草魚和鰱等鯉科魚類均易發(fā)生。腎炎型急性爛鰓可能由KHV[14-15]等病毒性病原引起，常見于普通鯉和錦鯉感染后發(fā)病。河南地區(qū)流行的鯉急性爛鰓病也同樣分為寄生蟲性爛鰓、細菌性敗血癥性爛鰓和腎炎型急性爛鰓，這3種爛鰓病在河南地區(qū)發(fā)病占比分別為1%～2%、60%～70%和30%～40%[3]。多家科研單位從河南鯉急性爛鰓病病魚中鑒定出KHV、柱狀黃桿菌、維隆氣單胞菌、霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、腐敗瓦希菌群等[3]。因此，在發(fā)生鯉急性爛鰓病時，應該通過臨床癥狀和實驗室檢測結果加以區(qū)分，做到有針對性地治療。

CEV感染主要發(fā)生于15～25 ℃，表現(xiàn)為普通鯉體表浮腫或錦鯉嗜睡，鰓潰爛壞死，眼睛凹陷[16]。此次鄭州某鯉養(yǎng)殖場暴發(fā)鯉急性爛鰓病時水溫約為23 ℃，病魚出現(xiàn)以唇與鼻之間凹陷、頭骨凹凸不平、眼睛凹陷、腎臟腫大至鰾間隔的主要臨床癥狀，發(fā)病水溫和部分臨床癥狀與鯉浮腫病毒感染相似。體視鏡下可見病魚鰓絲末端鈍圓，呈棒槌狀，形態(tài)不清，鰓絲周圍附有白色黏液，患病魚鰓絲和鰓小片組織結構嚴重受損，鰓絲上皮細胞增生、壞死脫落，鰓弓遠端和近端鰓小片均有明顯增生且相互融合，這和CEV的組織病理特征相吻合。Way等報道，被CEV感染的病魚鰓上皮細胞腫大并大量增生，鰓小片相互融合[16-17]。PCR方法從鄭州發(fā)病鯉僅檢出CEV，且基因序列與CEV中國分離株（AS1、WJ2016）及日本分離株（CyPP3）同源性約為98.8%，而細菌和寄生蟲檢測均為陰性，且養(yǎng)殖戶表述在鯉急性爛鰓病發(fā)生期間，使用抗生素無效反而加重其死亡，排除了致病性細菌和寄生蟲感染的可能。另外，徐立蒲等從河南5個出現(xiàn)有爛鰓癥狀的鯉養(yǎng)殖場中檢出CEV，而KHV均為陰性[18]。因此，初步推斷此次河南鄭州某鯉養(yǎng)殖場發(fā)生的鯉急性爛鰓病為腎炎型急性爛鰓病，其病原為CEV。但該結論還有待于通過柯赫氏法則做進一步驗證，并且由于鯉感染KHV后，其臨床癥狀和CEV感染的臨床癥狀十分相似[5，17]，所以臨床上可對CEV和KHV同時進行檢測，以盡快確定病因。

自1970年代日本新潟首次報道CEV以來，該病毒可能已通過錦鯉國際貿(mào)易傳播至世界其他國家[16]。2015年，我國首次在杭州某錦鯉養(yǎng)殖場鑒定出CEV[19]，隨后在云南[5]等多地均有確診。此次從河南鄭州患腎炎型急性爛鰓病病魚中檢出CEV，分析其P4a基因片段（357 bp）發(fā)現(xiàn)，與中國分離株（AS1和WJ2016）和日本分離株（CyPP3）同源性最高，均為98.8%，屬于Ⅱa基因亞型，推測CEV有可能通過錦鯉貿(mào)易從日本傳入我國，進而從錦鯉養(yǎng)殖體系傳入普通鯉養(yǎng)殖體系。目前，基于CEV P4a基因的遺傳進化分析，可將CEV主要分為Ⅰ和Ⅱ基因型;其中，CEVⅡ基因型可分為Ⅱa和Ⅱb這2個基因亞型[8]，并且隨著研究的逐步深入，可能會發(fā)現(xiàn)更多新的CEV基因型[20]。但這些新的基因型也需要更多的研究結果證實其科學性。

目前，對因CEV感染引起的急性爛鰓病尚無有效的治療措施，濫用藥物、大換水、拉網(wǎng)捕撈等刺激性措施均會加重病魚死亡，所以應以預防為主。日常應提高養(yǎng)殖場管理水平，避免外來水生動物或其他污染物進入養(yǎng)殖場;定期對養(yǎng)殖場進行疫病監(jiān)測;保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境，及時清理死魚;對水源進行嚴格管理，養(yǎng)殖廢水要進行無害化處理;同時在引進苗種時，一定要做好隔離檢疫。

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