甲狀腺腫瘤患者PCDH8基因啟動子的甲基化狀態及其臨床意義▲

朱明章 梁偉新 賴勇強 彭和平 黃尚書 馮偉兆 谷小玉 李林株 李志宏

(廣東省佛山市高明區人民醫院1 普外科，3 病理科，佛山市 528500,電子郵箱：358767716@qq.com；2 廣州醫科大學附屬第二醫院普外科，廣東省廣州市 510260)

甲狀腺癌是頭頸部和內分泌系統中最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，近年來其發病率呈上升趨勢[1]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺癌最常見的病理類型，發病率高，生長緩慢，預后較好，但易發生早期淋巴結轉移及術后復發[2]。研究發現，多種基因DNA甲基化與甲狀腺腫瘤的發生發展密切相關[3-8]。原鈣黏蛋白8(protocadherin 8，PCDH8)是鈣黏附蛋白家族中的一員，在細胞黏附、增殖、分化和遷移中起著重要的作用[9]。已有研究證實PCDH8基因為一個候選的抑癌基因，其通過突變或啟動子甲基化在多種癌癥中失活，包括乳腺癌、袖套淋巴細胞瘤、結直腸癌、腎細胞癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌等[10-19]。但目前關于PCDH8基因甲基化與甲狀腺腫瘤關系的研究仍鮮有報道。本研究檢測甲狀腺腫瘤和正常組織中PCDH8基因啟動子的甲基化狀態及蛋白表達水平，探討PCDH8基因啟動子甲基化與PTC臨床病理特征的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2013年6月至2016年12月期間在佛山市高明區人民醫院經手術切除甲狀腺組織的180例患者作為研究對象，其中PTC48例、甲狀腺濾泡狀腺瘤43例、結節性甲狀腺腫44例和正常甲狀腺組織45例，所有患者均經病理檢查確診，患者術前均未行放化療。納入標準：(1)PTC、甲狀腺腺瘤及結節性甲狀腺腫均符合2012年《中國甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌診治指南》；(2)年齡18～65歲；(3)入組前未接受放化療等治療。排除標準：(1)有其他惡性腫瘤病史或合并其他惡性腫瘤者；(2)合并其他嚴重基礎疾病者。本研究已通過佛山市高明區人民醫院醫學倫理委員會審查，且獲得所有研究對象知情同意。

1.2 試劑及引物 DNA提取試劑盒購自上海基因科技公司(批號：2018111401)，亞硫酸氫鹽修飾及純化試劑盒購自德國Qiagen公司(批號：20170531)，焦磷酸測序試劑盒(PyroMark Gold Q96 Reagents)購自德國Qiagen公司(批號：154037384)，免疫組化一抗人抗鼠PCDH8抗體購自美國SANTA CRUZ公司(批號：L-20170113)，二抗羊抗鼠IgG抗體購自美國BIOWORLD公司(批號：BS12471)，甲基化基因測序試劑盒購自德國Qiagen公司(批號：157025148)，DAB顯色液購自杭州協博醫藥公司(批號：20024970)；所有引物設計均采用Primer 5軟件設計，由上海英濰捷基公司合成并進行預實驗驗證。

1.3 焦磷酸測序檢測標本DNA甲基化 按試劑盒說明書步驟提取標本DNA，使用亞硫酸氫鹽修飾及純化試劑盒對提取好的組織DNA進行亞硫酸氫鹽修飾及純化，于-20℃保存備用。基因PCR擴增，亞硫酸輕鹽處理后測序，上游引物：5′-ATTAAAGGGATTGTTAGAGGTAGG-3′， 下游引物：5′-CTCATACCTCCAACCTCAAATAC-3′(5′端生物素標記)。按照下列反應條件進行擴增：95℃預變性2 min；95℃ 25 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環；72℃延伸10 min。反應產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳確認目的條帶。甲基化基因測序：制備含生物素標記DNA單鏈，按照PyroMark ID遺傳分析系統和試劑盒說明書，用序列分析和單核苷酸多態性模式進行測序位點分析。檢測位點：PCDH8基因啟動子，NCBI Reference Sequence：NC_000013.11(chromosome 13,GRCh38.p7，52848593-52848604)。檢測序列：CGGGTCCGCGCG。4個位點任意一個出現C，且測序比例大于20%，則表示發生甲基化；相反，4個位點C的測序比例均小于20%，則表示未甲基化。

1.4 免疫組化法檢測PCDH8蛋白表達 對石蠟包埋的甲狀腺標本進行厚度為5 μm的連續切片，標記、分類及晾干后放入60℃烤箱中烤片1 h。脫蠟后用pH=7.3的10 mM磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，5 min/次；使用3% H2O2浸泡標本15 min，微波爐低火阻斷內源性過氧化物酶5 min，再使用10 mmol/L檸檬酸鈉浸泡，高溫高壓(100℃～120℃，80～90 kPa)進行抗原修復，冷卻后采用PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次，加入PCDH8一抗(1 ∶100)4℃孵育過夜。次日，采用PBS緩沖液沖洗切片3次，5 min/次，滴入二抗IgG(1 ∶200)，37℃孵育40 min，PBS緩沖液再沖洗3次，5min/次，滴加DAB顯色液顯色3～5 min。水洗終止顯色，蘇木素染細胞核15 s，水洗、藍化、脫水、透明、封片。奧林巴斯CX31顯微鏡下觀察并照相。根據細胞顯色深淺記分，無陽性反應細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分， 0～2分判斷為PCDH8表達陰性，≥3分判斷為PCDH8表達陽性。

1.5 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計數資料以例數(百分比)表示，多組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；焦磷酸測序甲基化率和免疫組化基因表達調控率比較采用McNemar檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組甲狀腺標本PCDH8基因啟動子甲基化及蛋白表達情況的比較 4組甲狀腺組織的PCDH8基因啟動子甲基化焦磷酸測序及蛋白表達情況比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，其中PTC的PCDH8基因啟動子甲基化率高于正常甲狀腺組織，PCDH8基因蛋白表達陽性率低于正常甲狀腺組織(均P<0.05)，而其他3組的上述指標，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組甲狀腺組織PCDH8基因啟動子甲基化及蛋白表達情況的比較[n(%)]

2.2 PCDH8基因啟動子甲基化和蛋白表達調控的相關性 正常甲狀腺組織PCDH8蛋白表達陽性的24例標本中，PCDH8基因未發生甲基化為20例，重合率為83.33%。甲狀腺癌標本PCDH8蛋白表達陰性的37例標本中，有33例發生PCDH8基因啟動子甲基化，重合率為89.18%。對兩種檢測方法結果進行McNemar檢驗，焦磷酸測序和免疫組化檢測結果一致并無明顯差異(P=1.000)，說明基因啟動子甲基化和蛋白表達陰性存在一定相關性。

2.3 PTC患者PCDH8基因啟動子甲基化與其臨床病理特征的相關性 PTC患者PCDH8基因啟動子甲基化與淋巴結轉移有關聯性(P<0.05)，而與其年齡、性別、術前促甲狀腺激素水平、抗甲狀腺球蛋白抗體水平及腫瘤部位無明顯關系(均P>0.05)。見表2。

表2 PTC患者PCDH8基因啟動 子甲基化與其臨床病理特征的相關性(n)

3 討 論

抑癌基因失活是腫瘤發生發展的一個重要分子生物學事件。有研究證實，遺傳學和表觀遺傳學機制都可能導致抑癌基因失活[20-22]。研究表明，抑癌基因的高甲基化是腫瘤發生發展的特征之一，并可作為診斷和預后評估的生物標志物[20-21]。因此，抑癌基因的高甲基化水平在腫瘤的診斷、預后評估和基因靶向治療方面具有廣大前景。鈣黏蛋白被認為在癌癥的發生發展過程中起構建和維持組織結構的關鍵作用[22-25]。鈣黏蛋白家族分為經典鈣黏蛋白、橋粒鈣黏蛋白和原鈣黏蛋白。原鈣黏蛋白是鈣黏附蛋白超家族中最大的亞群，鈣黏附家族基因的異常啟動子甲基化被發現與多種癌癥的發生密切相關[10,26-28]。PCDH8是原鈣黏蛋白家族成員之一，已有研究發現其在不同的腫瘤基因中發生異常甲基化，導致PCDH8基因發生突變或表觀遺傳性沉默，而外源性表達PCDH8基因可抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，具有抑癌基因的作用[10-19]。

本研究觀察甲狀腺腫瘤中PCDH8基因DNA啟動子甲基化狀態及基因蛋白表達情況，結果顯示，PTC的PCDH8基因啟動子甲基化率高于正常甲狀腺組織，PCDH8基因蛋白表達陽性率低于正常甲狀腺組織(均P<0.05)，而甲狀腺濾泡狀腺瘤、結節性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織的PCDH8基因啟動子甲基化率和蛋白表達陽性率差異均無統計學意義(均P>0.05)，且PTC的PCDH8蛋白表達陰性率高達77.08%，PCDH8基因甲基化率高達81.25%，這表明與正常甲狀腺組織相比，PCDH8基因啟動子甲基化在PTC中更為常見。結合PCDH8基因的甲基化狀態和蛋白表達情況，本研究分析發現PCDH8基因發生甲基化與基因蛋白表達缺失在PTC的重合率為89.18%，這表明PCDH8基因甲基化與蛋白表達調控具有一定的關聯性，與國內外相關研究報道[10,15,17,19]的結果相符合。此外，有研究發現PCDH8基因甲基化與腫瘤患者的甲胎蛋白水平、預后、復發、轉移、腫瘤大小、組織形態、臨床分期和病理分級等具有相關性[17-19]。本研究結果顯示，PTC患者的PCDH8基因啟動子甲基化與淋巴結轉移相關(P<0.05)，而與其年齡、性別、促甲狀腺激素水平、抗甲狀腺球蛋白抗體水平及腫瘤部位無明顯關系(P>0.05)。這可能與抑癌基因的甲基化失活，其內在黏附、遷移、增殖功能改變，促進腫瘤的轉移侵襲有關。

綜上所述，PTC患者中的PCDH8基因啟動子甲基化率高，PCDH8蛋白表達水平低，PCDH8基因甲基化與蛋白表達調控具有一定的關聯性，且PCDH8基因啟動子甲基化與PTC患者的淋巴結轉移有相關性，或可作為甲狀腺腫瘤診斷和預后評估的一個潛在生物標志物。