脫細胞魚皮基質的制備、改性與應用前景

蘇東 ，冷凱良，劉小芳，張俊杰

1. 江蘇海洋大學海洋生命與水產學院（連云港 222000）；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業農村部極地漁業開發重點實驗室（青島 266071）

脫細胞真皮基質（ADM）是指不同來源的皮膚經脫細胞工藝處理，將皮膚組織中抗原性較強的組分，包括表皮、皮膚附屬器（毛囊、皮脂腺、汗腺）、真皮內的血管內皮細胞、成纖維細胞等去除后，所剩余的免疫原性相對較弱的細胞外基質及真皮層的膠原纖維網狀結構[1]。目前市場上常見的脫細胞真皮基質一般來源于豬、牛、羊和馬，它們的制作工藝和臨床應用已趨于完善[2-3]。然而，由于近年來牛海綿狀腦病（BSE）和高致病性禽流感（HPAI）等人畜共患病頻發，以及宗教信仰等因素，導致豬、牛等哺乳動物的脫細胞基質材料頗受爭議。而魚皮可以較好地規避宗教壁壘，且具有膠原蛋白含量高、抗原性低、生物安全性高和產量豐富等優勢[4]。

1 魚皮的結構基礎

1.1 魚皮的組成

魚皮一般是由魚鱗、表皮、真皮及皮下組織構成，可分為鱗面層、表皮層、真皮層和皮下組織層。表皮層中富含表皮細胞，可以分泌角質，真皮層主要由膠原纖維、糖胺聚糖、彈性纖維等組成，還有一些色素細胞、血管和脂肪組織等[5-6]。而哺乳動物的皮膚，如?；蜇i皮，一般是由表皮層、真皮層和皮下組織層組成；表皮層中富含角化細胞、基底細胞和色素細胞等；真皮層又分為乳頭層和網織層，主要由膠原纖維和彈性纖維組成，包括血管、淋巴管、毛囊、皮脂腺等[7]。

1.2 魚皮中的膠原蛋白

脫細胞基質材料的主要成分是膠原蛋白，魚皮的蛋白質含量比魚體的其他部位高，其膠原蛋白含量最高可占其蛋白質總量的80%以上[8]。Takeshi等[9]研究表明：鱸魚（Lateolabrax japonicus）皮、骨和鰭中的膠原含量分別為51.4%，40.7%和41.6%（干基）。而常見的哺乳動物皮膚，如豬皮中的蛋白質含量約為33%，膠原蛋白占總蛋白的比率為87.8%左右[10]。豬皮和魚皮中的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，具有由三條α-肽鏈以右手螺旋形式纏繞成的草繩狀三股螺旋結構。在顯微鏡下觀察，膠原由直徑2～15 μm的膠原纖維組成，多數成束狀結構，膠原束相互交織成網狀[11]，這種網狀結構有利于細胞的進入和生長。

1.3 魚皮中的脂肪酸

魚皮中含有豐富的不飽和脂肪酸，如Ω-3、二十碳五烯酸、花生四烯酸等，能有效抑制炎癥發生，減少機體的免疫排斥反應[12]，Sigurjonsson[13]在制作脫細胞魚皮過程中，去除了魚鱗和表皮脂肪，保留了真皮層中的脂肪。體外試驗表明，脫細胞魚皮基質表現出良好的生物相容性。而哺乳動物的油脂主要為飽和脂肪酸，并無抗菌、抗炎等生物學功能，一般在脫細胞前處理過程中將其去除。Baldursson等[4]研究發現，在全層皮膚損傷臨床應用中，脫細胞魚皮基質較豬小腸黏膜下層脫細胞基質的愈合速度快，生物相容性好，這可能與魚皮中的不飽和脂肪酸有關。

2 魚皮的脫細胞方法

國內外對于脫細胞魚皮基質的制備方法沒有統一的標準，因為魚皮特殊的物理性質（如變性溫度低[14]、網狀層結構復雜[15]等）導致常規的哺乳動物皮膚脫細胞方法并不完全適用。Sigurjonsson[13]報道一種用于創傷修復的脫細胞魚皮基質的制備方法。先去除魚皮表面的鱗片和表皮脂肪，用PBS浸泡以穩定魚皮內的三維結構，用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理去除細胞、Tris-HCl和0.05 μg/L胰蛋白酶裂解精氨酸和賴氨酸C端的多肽鍵（無脯氨酸連接）[16]，最后將所得的脫細胞魚皮基質經預凍液處理后冷凍干燥，再經環氧乙烷滅菌[17]。操作過程中全程控制溫度為4 ℃，魚皮經過提前凍融（-70 ℃），更利于脫細胞處理。制得的脫細胞魚皮基質較好地保留了膠原纖維三維支架結構。

國內學者王園園等[18]以沙鰻（Astroconger myriaster）魚皮為原材料，去除內側筋膜、脂肪和多余魚肉，用生理鹽水和超純水反復沖洗后抗壞血酸處理1 h，利用甲酸使基質溶脹并去除表皮層，用NaCl浸泡去溶脹，-80 ℃反復凍融使細胞裂解。之后用脫氧膽酸鈉、SDS和0.2 μg/L胰蛋白酶溶液進一步脫細胞，最后用生理鹽水洗滌干凈后凍干成型，60Coγ射線輻照滅菌。制得的脫細胞魚皮基質機械性能較好，較好地脫除了細胞，材料幾乎全為膠原纖維，無PAS陽性物質。同時其DNA含量明顯低于天然魚皮和市售口腔修復膜，在動物試驗中無致敏反應。

2種制備方法均是利用SDS和胰蛋白酶溶液進行脫細胞處理，SDS可以溶解細胞膜和核膜[19]，而胰蛋白酶主要作用于精氨酸和賴氨酸C端的多肽鍵[20]，在兩者的共同作用下可使細胞有效地裂解并將細胞碎片洗出。在組織的預處理中，可以提前通過反復凍融法破壞細胞，將組織置于低溫條件下（-20 ℃～-80 ℃），使細胞內形成冰晶，由于細胞內冰晶的形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起細胞溶脹，從而使細胞結構破碎[21]。

需要注意的是，脫細胞基質的主要成分是膠原蛋白，在未變性條件下，膠原蛋白對胰蛋白酶具有抗性，但是當膠原蛋白發生變性后，其原有的三螺旋結構會解旋，α-鏈易被蛋白酶酶解成肽段，膠原纖維的網狀結構會被破壞[22]。因此在脫細胞過程中，應該嚴格控制環境溫度和洗脫劑處理時間等因素。

3 脫細胞魚皮基質的改性

與哺乳動物相比，脫細胞魚皮基質的熱穩定性較差，水產膠原蛋白的變性溫度普遍低于哺乳動物膠原蛋白[23]，這與它們自身的溫度及所處生活環境有著密切關系[24]，在正常人體體溫條件下（37 ℃）也會發生變性，因此，必須通過技術手段提高脫細胞魚皮基質的穩定性。常用方法是交聯法，包括化學法、物理法和酶法交聯。

3.1 化學法交聯

化學法交聯是依靠化學交聯劑與膠原的相互作用，在膠原纖維間和膠原纖維內引入外源性交聯[25]。常用的化學交聯劑包括戊二醛（GTA）、碳化二亞胺（EDAC）、疊氮二苯基磷（DPPA）等。需要注意的是，化學法交聯雖然能夠提高基質的穩定性，但是必須考慮交聯劑在人體內的降解速率，即交聯劑的選擇、交聯的時間和交聯劑的濃度問題。近年來，有學者利用京尼平（Genipin）與膠原[26]、明膠、殼聚糖等交聯制作生物材料，交聯效果較好；京尼平的毒性遠低于戊二醛和其他常用的化學交聯劑。此外，某些天然交聯劑因為其毒性較低、交聯效果好等特點得到廣泛研究。Tan等[27]利用雙醛羧甲基纖維素鈉（DCMC）與膠原交聯制作膠原海綿，膠原的熱穩定性和機械性能明顯提高。

3.2 物理法交聯

物理法如電離輻射、紫外線照射等，X射線能夠在相鄰膠原纖維之間產生熱穩定的分子間交聯[28]，紫外線能與核黃素等光敏劑結合，在膠原纖維內和膠原纖維間形成羰基共價鍵[29]。與化學法交聯相比，物理法交聯能夠避免引入有毒化學物質，但是過程中溫度的升高會導致膠原蛋白的三螺旋結構被破壞，從而影響脫細胞魚皮基質的三維結構。Davidenko等[30]利用紫外線對牛膠原進行交聯，過程中引入葡萄糖來提高交聯效果，同時防止膠原蛋白三螺旋結構解旋，交聯后的膠原蛋白三維結構得到較好保留，穩定性也有顯著提高。

3.3 酶法交聯

酶法交聯一般是利用酶的特異性催化，如賴氨酸氧化酶能夠特異性地催化膠原分子N端和C端末端肽區的賴氨酸/羥賴氨酸修飾成α-氨基己二酸半醛。這些新形成的醛與未修飾的賴氨酸或羥賴氨酸殘基縮合形成交聯[31]。常用的酶還包括谷氨酰胺轉氨酶，它通過催化酰基轉移反應，谷氨酰胺殘基的g-甲酰胺基團作為?；w，賴氨酸殘基的e-氨基基團起?；荏w作用。通過酰胺鏈與賴氨酸和谷氨酰胺殘基的側鏈實現交聯[32]。Nicolas等[33]證明，用轉肽酶SortaseA交聯得到的水凝膠細胞相容性較好，安全性較高。

4 脫細胞魚皮基質的優勢

4.1 生物相容性好

脫細胞組織的主要成分為膠原蛋白，而膠原蛋白具有免疫原性低[34]、生物降解性好[35]等特點，曾經被認為是一種無抗原性的生物材料[36]。近年來，隨著基因工程技術發展，發現膠原蛋白非螺旋末端區的端肽會引起一定免疫原性[37]，而脫細胞過程中加入胰蛋白酶可以有效地去除端肽，降低膠原蛋白本身的免疫原性。經過脫細胞處理的魚皮不含細胞，一般通過H&E染色和Masson染色[38]判斷有無細胞核殘留以及膠原纖維和肌原纖維的含量。

4.2 生物降解性強

Baldursson等[4]對比豬小腸黏膜下層脫細胞基質和脫細胞魚皮基質在全層皮膚損傷治療時的愈合速率及生物安全性，采用酶聯免疫（ELISA）法分析抗核抗體（ANA）、抗鹽水可提取性抗原多肽抗體譜（ENA）、抗雙鏈DNA抗體（DSDNA）和抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）等。結果表明：脫細胞魚皮基質的愈合速度更快，術后28 d傷口完全閉合，生物相容性更好，過程中沒有發生免疫排斥反應。脫細胞魚皮基質的良好抗炎性可能與魚皮中富含Ω-3等不飽和脂肪酸有關。Ω-3脂肪酸能夠刺激巨噬細胞，通過抑制NLRP3炎癥小體的活化來預防炎癥和代謝紊亂[4]。

4.3 三維結構更利于細胞的遷移與增殖

相比于豬、羊、牛皮，魚皮的網狀層結構有著不同的編織方式，前者的網狀層編織是立體三維，方向基本均一，而魚皮各個網狀單元層呈平面二維編織形式，各個網狀單元相互疊加，其間主要靠一些縱向細小的膠原纖維束連接[18]。體外試驗表明，魚皮脫細胞基質的三維網狀結構比豬或牛皮脫細胞基質更利于細胞的遷移與增殖，可促進血管的再生[39]。

4.4 排除人畜共患病威脅

哺乳動物傳染性疾病多發，魚類特殊的生存環境和魚皮特有的防護機理，人畜共患病的傳播風險遠低于哺乳動物。魚皮中可能存在寄生蟲等危險，但脫細胞過程中pH的變化，及脫細胞產品常用的環氧乙烷滅菌處理，能夠得到有效去除。

4.5 規避宗教問題

在某些特殊地區，因為宗教信仰等因素，不能使用豬或牛組織提取的膠原蛋白[40]，限制了脫細胞豬皮、牛皮基質在這些地區的臨床應用。而脫細胞魚皮基質則沒有這些困擾，這也是近年來提倡使用魚皮膠原蛋白來替代傳統的豬皮或牛皮膠原蛋白的原因。

4.6 水產資源豐富

我國的海岸線總長達3.2萬余 km，具有豐富的水產資源。近年來，國家在不斷強調對海洋資源的合理開發和利用，提倡中國應該堅持走依海富國、以海強國、人海和諧、合作共贏的發展道路[41]。魚皮作為水產加工副產物，一直以來利用率較低。若用脫細胞魚皮基質替代脫細胞豬皮/牛皮基質，應用于組織修復和整容整形行業，將進一步提高水產資源利用率。

5 脫細胞魚皮基質的臨床應用

最早的脫細胞魚皮產品是美國FDA于2013年批準的KerecisTM，主要用于慢性潰瘍創面治療。該產品在結構上與脫細胞牛皮基質和脫細胞豬皮基質相似，但是，在魚皮的前處理階段保留了真皮層中的脂肪，因為魚皮脂肪中含有豐富的Ω-3等不飽和脂肪酸，有利于降低炎癥反應，能夠誘導細胞向創傷區域轉移[42]。Yang等[42]對KerecisTM的治療效果進行測試，結果表明在慢性潰瘍創面治療中，KerecisTM表現出優良的修復效果，患者使用KerecisTM5周后，創面面積減少40%，創面深度減少48%。此后，深入研究了脫細胞魚皮基質。Magnússon等[43]選用大西洋鱈魚（Gadus morhua）魚皮制作脫細胞魚皮基質，用于糖尿病等慢性潰瘍的再生修復。Kjartansson等[44]探究KerecisTM對硬腦膜缺損的修復作用。王園園等[18]選用沙鰻魚皮制作脫細胞基質，用于口腔醫學中組織修復。

6 脫細胞魚皮基質制備中存在的問題

脫細胞魚皮基質作為一種新型生物支架材料，具有廣闊的應用前景。然而，在產品開發和生產中，必須注意幾個問題。

6.1 魚皮種類的選擇

不同種類的魚皮在結構上存在差異，理想的脫細胞魚皮材料應該具有雙層結構，一面光滑、一面疏松多孔，有利于細胞的遷移和黏附。而有些魚皮材料（如黑魚Channa argus）呈現出平滑結構，在電鏡觀察下，兩面均無孔隙結構[38]，不利于細胞的遷移和生長。常用的脫細胞魚皮來源包括鱈魚（Gadus）、馬面魚（Thamnaconus septentrionalis）和沙鰻魚。

6.2 季節對于魚皮性質的影響

Duan等[45]研究發現，捕撈的季節對鯉魚（Cyprinus carpio）魚皮明膠的理化性質（氨基酸組成）和流變學特性（黏度特性、凝膠強度和熔點）會產生一定影響，夏季魚皮明膠的穩定性明顯高于冬季。因此，為了保證脫細胞魚皮基質的性質穩定，選用魚皮來源及捕撈時間需要合理的規劃。

6.3 交聯方法和交聯劑的選擇

魚皮膠原蛋白的變性溫度一般低于37 ℃，在臨床應用中容易發生熱變性?？梢酝ㄟ^交聯來提高脫細胞魚皮基質的機械強度和熱穩定性。最常用的化學交聯法交聯效果較好，但會引入外來有害物質，必須考慮交聯劑在人體內的降解速率。

6.4 皮下脂肪的保留

不同于哺乳動物皮膚，魚皮中含有豐富的不飽和脂肪酸，如Ω-3、二十碳五烯酸、花生四烯酸等，能夠一定程度抑制炎癥發生，因此在脫細胞前處理中，可以選擇性地保留真皮層中的脂肪。

7 結語與展望

近年來，隨著生物技術的進步和動物福利的改善，魚類在生物醫學中的應用受到廣泛關注，常被用作為陸生哺乳動物的替代模型[46]。除研究魚皮脫細胞外，國外學者還對魚體其他部位的生物學功能進行探討。如Kumar等[47]討論脫細胞魚鰾基質在皮膚創面愈合修復中的應用前景。相比于國外相對成熟的脫細胞魚皮基質制作工藝和評價體系，我國對于脫細胞魚皮基質的研究才剛剛起步，相關文獻也較少。王園園等[18]提出一種利用沙鰻魚皮制作脫細胞基質的新工藝，作為引導組織修復膜應用于口腔醫學中。祖麗皮也·阿不力克木等[38]探究了馬面魚、黑魚、沙鰻魚（Astroconger Myriaster）、鯉魚和鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）魚皮制成的脫細胞基質的理化特性。結果發現，馬面魚脫細胞魚皮基質具有多孔孔隙結構，更接近理想的組織工程支架材料，利用魚皮制備脫細胞基質可行，也完善了脫細胞魚皮的制備方法。但是，對于脫細胞魚皮基質的改性及如何保證規模化生產時產品質量的均一性，仍需要進一步研究與探討。