生物被膜對食品工業的危害與控制

李南薇，劉功良，高蘇娟，白衛東，賈愛娟

1. 仲愷農業工程學院輕工食品學院（廣州 510225）；2. 廣東美味鮮調味食品有限公司（中山 528437）

長期以來，細菌被認為以浮游狀態存在。隨著電子掃描顯微鏡出現，發現大多數細菌在一定條件下會吸附在特定表面，并增殖形成群居膜狀結構，這種由附著于載體表面的細菌細胞和包裹細菌的水合性基質所組成的結構性細菌群落被稱為生物被膜（Biofilm）。生物被膜廣泛存在于各種潮濕表面，是細菌粘附于載體表面生存時的一種特殊狀態[1-3]。任何細菌在特定的條件下均能形成生物被膜，常見的被膜態致病菌包括單核細胞增生性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎桿菌和銅綠假單胞菌等[4]。

在自然環境中，生物被膜是多數細菌的溫床，它賦予細菌對環境壓力的抗性。生物被膜幾乎存在于各種物體表面，如水槽表面、廚房角落、魚缸內壁、空調冷凝水出水管內壁、動物表皮、牙齒、溪流中的小石塊、船只、醫療器械、生產設備等，對日常生活產生廣泛影響[5-6]。

食品加工的主要目的是為消費者提供美味、健康、安全的食品。食品安全是保護人類健康，提高人類生活質量的基礎，無論是在發展中國家還是發達國家，人類健康均遭受著食源性疾病的威脅。據估計，每年全球大約三分之一的人有犯食源性疾病的經歷。食源性病原菌是導致食物變質和引發食源性疾病的主要因素，也是食品安全要面對的長期難題。國內外過去的研究工作主要集中在食品中游離態致病致腐微生物上[7]。然而，越來越多研究表明，細菌生物被膜、亞致死細胞的修復及病毒的變異等問題是食品安全的重要隱性危害，也是導致食源性疾病爆發的重要原因[7]。據估計，65%～80%細菌性感染是由生物被膜引起的[8]。其中，食品工業中形成的生物被膜最有可能是食源性疾病的罪魁禍首。如在食品發酵中，一些腐敗菌和病原菌會形成生物被膜，從而導致最終產品的腐敗和疾病的爆發。因此，食品工業中生物被膜對食品安全的威脅不容忽視。

1 生物被膜的結構與特性

生物被膜結構復雜，且其結構、生理學特性和化學特性隨著微生物種類和環境的變化而不同。通常，生物被膜主要由細菌、營養物質、細菌分泌的代謝產物及裂解產物和水等組成，其中水分可達97%，細菌分泌的胞外聚合物組分（EPS）主要包括蛋白質、胞外多糖、DNA和磷脂等生物大分子[1-2,9]。

大多數胞外多糖帶負電荷，可從周圍環境吸引各種有機物和無機物，故生物被膜的形態因細菌及環境的不同而異。如克雷白桿菌的胞外多糖復合物堅硬，且均勻分布于細菌表面，而銅綠假單胞菌表面則形成一種柔韌并有一定厚度的多糖蛋白復合物。然而，不同生物被膜的結構卻驚人地相似，都由水化的多陰離子基質和包繞于其中的細菌所組成。生物被膜游離端由73%～98%細胞外物質和空隙組成，所以這種結構被形容為被膜“建筑物”[10]。

基于在生物被膜內位置的不同，可將細菌分為游離菌、表層菌和深層菌。處于生物被膜不同位置的細菌存在著生理狀態、形態、代謝及基因表達等方面的差異。表層菌與游離菌比較相似，相對容易獲得營養和氧氣，代謝活動較旺盛，故菌體較大；深層菌由于處于生物被膜深處，營養物質貧乏，代謝廢物濃度高，其養料的獲取及代謝物的排出只能通過周圍的水通道進行，在惡劣的生存條件下，會主動或被動地降低代謝活動，甚至轉入休眠狀態，一般不會頻繁地分裂，菌體相對較小[11]。深層菌越接近吸附物體表面，pH和氧濃度較低，往往生長緩慢甚至不生長，通過降低自身代謝、節約能量、改變表現型、增強抗性和自身毒性，保護細胞免受環境壓力改變的影響，并且增強抵抗抗生素、消毒劑及機體免疫系統的殺滅、吞噬作用等。更重要的是，微生物一旦形成被膜即可為細胞粘附提供新位點，使游離微生物個體不斷粘附于被膜上；同時，個體也不斷從被膜內釋放或游離出來，使被膜成為慢性傳染源[5,8]。

生物被膜作為一種特殊的細菌生長和生存方式，具有特點[12-13]：（1）生物被膜是細菌在自然界的主要存在形式，是不同于浮游菌的一種群體生長方式；據估計，在自然界超過90%的細菌是以生物被膜形式存在的。（2）生物被膜中的細菌群體是被細菌分泌的聚合物組分包裹的，生物被膜中生物體數量高于其它所有方式存在的生物體數量總和。（3）生物被膜內的細菌群體具有一定功能和組織。（4）生物被膜是細菌為適應環境的一種生命現象，在不利于其生長或存在條件下，細菌間相互粘連，并分泌聚合物基質形成膜狀物；生物被膜中的細菌，具有更強的環境壓力抗性。

2 生物被膜的形成過程

隨著近年來透射電鏡、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡等先進儀器的應用，發現生物被膜的形成是一個動態過程，主要包括5個階段[9,13-15]。

2.1 細菌定植

即細菌的初吸附。構成生物被膜的初始細胞僅有少量EPS，并且多數細菌能夠借助菌毛獨立運動。此階段的吸附可逆，因為吸附的微生物還未進行分化，許多細菌可以從載體表面游離出來成為浮游菌。

2.2 粘附

即不可逆吸附過程。從可逆吸附過程轉變為不可逆吸附，意味著在EPS存在條件下，細菌與載體表面的相互作用變強。細菌粘附在載體表面后，需要高強度的剪切力或者利用酶、去污劑、表面活性劑、消毒劑或者加熱破壞細胞與載體表面的吸附才能除去生物被膜。被吸附細菌會產生一種多糖，增強細胞間的吸附作用。

2.3 微菌落的形成

微生物進一步生長繁殖，并聚集形成微菌落，同時產生EPS，增強細菌與基質間的鍵合作用，提高菌落對環境壓力的抗性。通過細胞間化學信號的相互傳遞，微菌落不斷從周圍介質中吸納浮游菌。微菌落的形成對于生物被膜的成熟非常有利，因為微菌落形成后，種群間即能進行養分交換，從而促進生物被膜的成熟。

2.4 分化成熟

經過不斷分化成熟，微菌落依賴于養分的不同最終形成扁平狀或蘑菇狀的高度組織化結構。生物被膜完全達到成熟通常需要10 d或更長時間。成熟的生物被膜結構具有不均質性，由微菌落組成，微菌落之間圍繞著水通道，可供運送養料、酶、代謝產物和排泄廢物等。

2.5 播散

外部條件的改變如增強流體剪切力和生物被膜內部環境的變化如內部酶解的發生、EPS和表面鍵合蛋白的解離都可能導致生物被膜脫離。生物被膜的脫離是一個主動過程，因為這使得部分細菌離開菌群，并向遠處播散繼續分裂增殖，啟動一個新的生物被膜形成過程。同時，饑餓也可能導致生物被膜脫落。脫落后，細菌可以尋找新的養分充足的環境。

3 生物被膜的危害

無論是在發展中國家還是發達國家，食品污染成為威脅公眾健康的一個重要問題。據疾控中心報道，1996—2010年，在美國平均每年約1 000例食源性疾病爆發，導致4 800萬人患病，12.8萬人住院，3 000人死亡[16]。研究發現許多病原性疾病的爆發與生物被膜有很大關系。在美國，約80%的持續性細菌感染案例與生物被膜有關。

生物被膜是微生物為適應自然環境而特有的生命現象。生物被膜態微生物與常見的浮游態微生物相比有著顯著的不同，表現為其抗性更強、危害更大，且更難清除[17]。據報道，生物被膜態菌對各種化學殺菌劑的敏感程度只是同種浮游菌的1/10～1/1 000。由于生物被膜態菌對消毒劑的抗性更強，故生物被膜給食品工業帶來嚴重的食品安全問題。從食品生產到消費的各個階段均可能感染微生物，特別是腐敗菌和病原菌易粘附于食品表面，在食品加工系統中形成生物被膜。生物被膜一旦形成，不僅會污染食品、增加設備清洗難度，使就地清洗系統（CIP）失效，成為其他有害微生物的藏身之地，還會腐蝕食品加工和貯運設備，帶來嚴重危害[16,18]。此外，生物被膜還會促使更多細菌協同共生，使設備內外表面成為傳播食源性疾病的隱性生物危害源，導致難以解決的食品質量與安全問題[5,19]。

楊公明在主持“十五”國家蘋果汁重大專項時，發現蘋果濃縮汁生產線在開工1個月后幾乎所有設定的CIP均不能保證自動清洗的質量，因此注意到生物被膜的危害，研究發現蘋果濃縮汁產品中耐熱菌超標是由于在超濾設備及生產線內部形成生物被膜從而大幅增強細菌對熱及殺菌劑等的抵抗力，使原先設定的CIP無效；通過對CIP系統改進，這一問題才得以解決[7]。2008年加拿大Maple Leaf Foods公司曾因食品加工設備清洗不徹底，產品被單增李斯特菌污染，導致20余人死亡，直接經濟損失5 000余萬美元[5,20]。因此，食品加工過程中，生物被膜的控制和清除對保障食品安全尤為重要。

4 生物被膜的控制和清除

4.1 抑制生物被膜的形成

被膜態菌與浮游菌有著顯著的不同，其抗性更強、更難清除且危害更大。因此，在生物被膜尚未形成前采取措施抑制生物被膜的形成是控制生物被膜的首選。生物被膜傳感器可檢測到物體表面的細菌群落，故可以在生物被膜成熟之前為其控制提供明確的指示。Pereira等[21]發明一種表面感應器，不僅能檢測到形成初期的生物被膜，還能檢測到清洗載體表面所用的試劑，識別出是何種清洗劑（生物或化學清洗劑），并計算出清除率。但在食品工業中，很難通過頻繁消毒抑制生物被膜的形成，故選擇不易形成生物被膜甚至能抑制生物被膜形成的材料作為食品加工接觸表面是抑制被膜形成的重要途徑。Rogers等[22]以自來水為唯一營養物質，研究8種不同管道材料上生物被膜的吸附情況，發現沒有一種材料能完全抑制被膜的形成；其中，不銹鋼片和聚丙烯管道上的生物被膜菌較少，而乳膠和乙丙橡膠管道上的生物被膜菌最多。Fujii等[23]對比研究金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合菌在包被共聚物（由2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸正丁酯組成）的不銹鋼板和對照鋼板上的生物被膜形成情況，發現包被共聚物的不銹鋼板能抑制生物被膜的產生。近年來，一些含抑菌劑成分的食品包裝材料在抑制食品表面病原菌和腐敗菌的生長方面表現出廣闊的應用前景。Knight等[24]發現含桿菌素的食品材料可有效抑制肉類加工中單核細胞增生性李斯特菌的吸附。Donlan[25]報道單核細胞增生性李斯特菌在含有尼生素的接觸表面的污染概率遠低于對照組。Davies等[26]發現抗生素和低電流聯合作用產生的生物電效應可有效抑制生物被膜形成。

研究發現，某些化學試劑可顯著抑制生物被膜的形成。Shanks等[27]研究檸檬酸鈉濃度對抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響，發現濃度大于0.5%時，可有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成；相反，濃度低于0.5%時，會促進大多數金黃色葡萄球菌菌株生物被膜的形成。Furukawa等[28]考察33種常用食品添加劑對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌生物被膜的抑制作用，發現21種食品添加劑具有抑制生物被膜活性，其中蔗糖酯的抑制效果最好，且抑制效果隨糖酯中脂肪酸碳鏈的增長而增強。但還沒有一種方法能完全有效抑制生物被膜的形成[16]。

4.2 生物被膜的清除和殺滅

成熟生物被膜的清除通常是指利用物理或化學的方法破壞生物被膜的結構，使其從附著物表面脫落。在食品工業中，清洗和消毒對產品的品質極為關鍵[29-30]。Gibson等[31]發現高壓噴射和機械地板洗滌器是清除生物被膜最有效的方法之一。表面活性劑或堿性化合物等化學試劑常用于清洗，它們通過減小表面張力、乳化脂肪、使蛋白質變性來懸浮或溶解食物殘渣[32]。清洗過程必須能夠有效破壞或溶解生物被膜的胞外多糖，從而為消毒劑提供接觸深層菌的通道[16]。好的清洗工序盡管能去除90%甚至更多的微生物，但不能完全被殺滅。假以時日，微生物會重新吸附于載體表面，在富含水和營養物的條件下重新形成生物被膜。因此，清洗以后必須進行消毒[33]。

消毒即用消毒劑殺滅生物被膜中的微生物，目的是殺滅清洗后殘留在載體表面的微生物，阻止其再次形成被膜。通常在缺乏有機物（如脂肪、碳水化合物、蛋白質等）條件下，消毒劑的滅菌效果更好。此外，有機物種類、pH、溫度、水的硬度、化學抑制劑、消毒劑濃度及接觸時間也是影響消毒效果的重要因素[34]。陳秋云等[35]研究二氧化氯對不銹鋼表面的金黃色葡萄球菌生物被膜的滅菌效果，發現有效氯質量濃度100 mg/L時，作用15 min后，殺菌率100%；但是，有機營養物的存在會極大地降低二氧化氯的滅菌效果。Saitou等[36]研究酒精、冼必太、10%聚維酮碘、0.1%苯扎氯銨、0.1%烷基二甲基乙酸安泰樂和0.2%苯扎氯銨對銅綠假單胞菌生物被膜的殺滅效果，發現除0.1%烷基二甲基乙酸安泰樂外，其余5種殺菌劑對浮游菌的殺滅率幾乎為100%；而對被膜態菌，只有0.1%苯扎氯銨的殺滅率不變，其余殺菌劑的殺菌效果均下降顯著。

食品工業對殺菌劑的使用有嚴格的要求，殺菌劑必須安全、有效、使用方便、用完后能從載體表面去除、無毒性殘留。但傳統的化學殺菌劑只在高濃度、大劑量時才對生物被膜有較顯著的殺滅作用，但高濃度、大劑量化學殺菌劑的使用對人類健康構成嚴重威脅。另外，一些細菌可能會通過基因突變等方式對殺菌劑產生一定抗性及生理塑性[16,37]。

近年來，植物來源的殺菌劑越來越受到人們的關注，因為天然殺菌劑對人體和動物相對安全。Nostro等[38]報道牛至精油和2種酚類化合物對金黃色葡萄球菌生物被膜的殺滅濃度分別為0.25%～1.00%和0.125%～0.5%，并且亞殺滅濃度的精油能抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。

酸性電解水是一種無色、透明、無明顯刺激性氣味的安全型消毒液，誕生于20世紀80年代后半期，用于殺滅耐甲氧四林的金黃色葡萄球菌。與傳統殺菌劑比，酸性電解水具有殺菌效果好、成本低、環境友好等優點，被廣泛應用于食品、農業、醫療、畜產、水產等領域[39]。研究表明酸性電解水能有效殺滅生物被膜[40]。

此外，一些生物法如酶法和噬菌體在去除生物被膜中逐漸受到關注。食品工業中，酶是一種用來消除生物被膜的綠色制劑。柴子涵[4]發現利用噬菌體聚糖酶對生物被膜進行預處理能顯著提高二氧化氯對生物被膜的殺死率。酶可以通過降解EPS破壞生物被膜結構，使菌體釋放出來，從而達到去除生物被膜目的。Orgaz等[41]研究來源于黑曲霉、木霉、青霉的酶去除細菌生物被膜的效果，發現以果膠為碳源，黑曲霉和青霉所產的酶可有效降解假單胞菌生物被膜，達到工業清洗的要求。如果輔助使用一些簡單的物理或化學殺菌方法，能顯著增強酶的作用效果。Oulahal-Lagsir等[42]發現聯合使用紫外照射、蛋白酶及多糖降解酶能有效去除不銹鋼表面的大腸桿菌生物被膜。聯合使用酶和殺菌劑可顯著提高生物被膜的去除率[43]。蛋白酶和表面活性劑的聯合使用可增強生物被膜的潤濕性，從而提高清洗效率[44]。多酶聯合作用或與其他試劑協同作用是今后利用酶控制生物被膜的主要研究方向。

噬菌體在自然界中廣泛存在，能侵染并破壞細菌，為生物被膜的控制提供一種專一、天然、靈敏、無毒的方法[45]。接觸到被膜菌是噬菌體有效降解生物被膜的關鍵。許多噬菌體能產生胞外多糖降解酶或細胞溶解素，降解被膜菌的保護屏障，使噬菌體能夠接觸到細菌，并識別細菌表面受體，進而侵染并裂解被膜菌，從而達到較高的生物被膜降解率[46]。少量噬菌體在短時間內即可裂解細菌，并快速繁殖大量子代噬菌體，高效破壞生物被膜[47]。故噬菌體在生物被膜控制中的應用表現出廣闊的應用前景。Sanna等[48]報道噬菌體phiIBB-PF7A可在短時間內高效破壞并除去熒光假單胞菌生物被膜。

5 展望

展示生物被膜在食品加工中的危害及其防治重要性，盡管抑制生物被膜的形成是食品加工過程中生物被膜控制的首選途徑，但是由于生物被膜在自然界中廣泛存在，并且其具有較強的環境抗性，故難以完全抑制生物被膜形成。生物被膜一旦形成，就必須使用各種方法清除并殺滅。從分子水平進一步研究生物被膜的形成機制、抗性機制，為實際生產中生物被膜的預防與控制提供理論依據和參考，從而保證食品安全和人體健康。